タッチサンプルからの単一細胞やヒト常在微生物叢を標的とした個人識別法の開発

• Project/Area Number: 22K10600
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 58040:Forensics medicine-related
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 浅利 優 旭川医科大学, 医学部, 准教授 (40360979)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 悠太 旭川医科大学, 医学部, 助教 (90894262)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: タッチサンプル / 個人識別 / 一塩基多型 / シングルセル / 常在微生物叢 / 次世代シークエンサー / ヒト常在微生物叢

Outline of Research at the Start

接触により付着した試料であるタッチサンプルはごくわずかなヒト由来の細胞しか含んでいないため、現在のDNA鑑定の主流となっているSTR型が検出されない場合も多い。また、タッチサンプルは複数人のDNAが含むことも多く、結果の解釈が複雑かつ困難なものとなっている。本研究では、究極の微量試料である単一細胞からの個人識別法の構築を目的として、次世代シークエンサーを用いた大規模なDNA型解析による一細胞解析を行う。また、皮膚のヒト常在微生物叢解析における高感度な手法を明らかにすることで、接触範囲などの立証方法としての活用を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

次世代シークエンサーを用いた個人識別に有効な一塩基多型（SNP）解析法の構築として座位数を増やした解析条件を検討するとともに、単離した細胞から全ゲノム増幅による解析方法を検討した。前年度に検討した1153座位から2061座位へと増やしたプライマーセットを作成して、120人のDNAからSNP解析を行った。1反応あたり標準的な10ngのDNAを使用した場合では2045座位で検出可能であることを確認できた。また、10ngよりも少ないDNA量で判定成功率を検討したところ、1ngや0.5ngでも99%以上と高く、0.1ngを使用した場合でも97%であることが明らかとなった。微量なDNAでは判定成功率以外にもヘテロ接合体のアリルカバレッジレシオが高い数値であった。さらに単離した細胞からの全ゲノム増幅にはPicoplex Single Cell WGA Kit v3（タカラ）を用い、増幅産物はAMPure XP（ベックマンコールター）を用いて精製し、Qubit 4 Fluorometer（サーモフィッシャー）にてDNA濃度を測定した。増幅産物が確認できた場合に10ngを鋳型としてSNP判定を行った。1反応あたりの細胞数は1から5個として検討を行ったところ、細胞1個では安定して増幅産物が得られなかった。一方、細胞2個以上の場合ではDNA濃度が高値となる場合が多く、増幅産物が得られたことをDNA濃度から明らかにすることが可能であった。細胞2個以上を鋳型としたSNPの型判定では細胞数が多くなるにつれて判定成功率が高くなり、特に高い場合では80%程度となった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

微量DNAからの高感度な一塩基多型解析法を構築することが可能であり、全ゲノム増幅により単離細胞からの型検出を行うことができた。

Strategy for Future Research Activity

単離した細胞1個から多くの型判定が可能となる高感度な全ゲノム増幅法を明らかにするとともに、微生物叢の解析を合わせて行う。