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Investigation of cartilage metabolism by extracellular matrix tenascin X

Research Project

Project/Area Number 22K11339
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 59010:Rehabilitation science-related
Research InstitutionShimane University

Principal Investigator

山田 和夫  島根大学, 医学部, 特別協力研究員 (30240005)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 松本 健一  島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 教授 (30202328)
Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords細胞外マトリックス / テネイシンX / 軟骨代謝 / エーラス・ダンロス症候群 / アグリカン / II型コラーゲン
Outline of Research at the Start

細胞外マトリックスタンパク質であるテネイシンX(TNX)は、関節、皮膚などに脆弱を来すことが知られている類古典型エーラス・ダンロス症候群(EDS)の原因遺伝子として同定された。我々は、これまでに、TNXはコラーゲン線維形成に関与することから、皮膚過伸展に関するEDSに特徴的な所見と関連することを示した。一方、TNX-KO(TNXノックアウト)マウスを用いた解析から、TNX-KOマウスでは破骨細胞への分化が促進し、骨量が減少することを明らかにした。しかしながら、これまで軟骨細胞自身が軟骨変性に関わる研究はほとんどなされていない。本研究では、TNXによる軟骨代謝機構を解明することを目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

細胞外マトリックスタンパク質であるテネイシンX(TNX)は、関節、皮膚などに脆弱を来すことが知られている類古典型エーラス・ダンロス症候群(clEDS)の原因遺伝子として同定された。本研究は、TNXによる軟骨代謝機構の解明を目的とし、初年度に続きTNX-KOマウスの軟骨分化の解析を行った。軟骨細胞への分化は、野生型(C57BL/6J)マウス及びTNX-KOマウスの初代軟骨細胞を用い、軟骨分化マーカーであるII型コラーゲン、アグリカン、軟骨分解酵素であるADAMTS-4, ADAMTS-5の発現を定量PCRにて解析した。その結果、TNX-KOマウスでは野生型マウスに比べ、II型コラーゲン、アグリカンの発現が有意に減少することが確認された。ADAMTS-4, ADAMTS-5の発現はTNX-KOマウス及び野生型マウスで差異は認められなかった。さらに、ウェスタンブロット法を用いてII型コラーゲン、アグリカンのタンパク量を解析したところ、TNX-KOマウスでは野生型マウスに比べ、II型コラーゲン、アグリカンのタンパク量が減少する傾向が認められた。また、C3H10T1/2細胞を用いた軟骨分化の解析では、野生型C3H10T1/2細胞におけるTNX の発現レベルが非常に低く、新たにTNX過剰発現C3H10T1/2細胞株を作成し、野生型C3H10T1/2細胞及びTNX過剰発現C3H10T1/2細胞を用いて検討した。野生型C3H10T1/2細胞及びTNX過剰発現 C3H10T1/2細胞に、骨形成因子-2(BMP-2)を添加し、II型コラーゲン、アグリカン遺伝子の発現を定量PCRにより解析したところ、TNX過剰発現C3H10T1/2細胞が野生型C3H10T1/2細胞に比べ、II型コラーゲン、アグリカンの発現が有意に増加した。これらの結果より、TNXが軟骨分化に関与する可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

野生型(C57BL/6J)マウス及びTNX-KOマウス初代軟骨培養細胞を用い、さらにTNX の軟骨細胞への分化の関与を定量PCRを用いて解析し、TNX-KOマウスでは野生型マウスに比べ、II型コラーゲン、アグリカンの発現が有意に減少することが確認された。 また、定量PCRに加え、ウェスタンブロット法を用いてII型コラーゲン、アグリカンのタンパク量を解析したところ、TNX-KOマウスが野生型マウスに比べ、II型コラーゲン、アグリカンのタンパク量が減少する傾向が認められた。さらに、初年度、野生型C3H10T1/2細胞におけるTNX の発現レベル非常に低いことが判明したため、TNX過剰発現C3H10T1/2細胞株を作成し、野生型C3H10T1/2細胞及びTNX過剰発現C3H10T1/2細胞を用いて比較した。骨形成因子-2(BMP-2)で軟骨分化させると、TNX-過剰発現 C3H10T1/2 細胞では野生型C3H10T1/2細胞に比べ、II型コラーゲン、アグリカンの発現が有意に増加した。これらのことから、TNX が軟骨分化に関与する可能性が示唆された。しかしながら、野生型C3H10T1/2細胞及びTNX過剰発現C3H10T1/2細胞を軟骨細胞に分化させた際の、TNXが細胞増殖、アポトーシス及ぼす効果については検討できなかった。このことを考慮して「やや遅れている」とした。

Strategy for Future Research Activity

TNXによる軟骨代謝機構をさらに解明するため、(1)TNX-KOマウスを用いて軟骨代謝機構を解析する。(a)マウス関節軟骨初代培養細胞による軟骨分化に関わる分子の同定:野生型(C57BL/6J)マウス及びTNX-KOマウスの初代軟骨培養細胞を用いて遺伝子発現解析を行い、野生型マウス及びTNX-KOマウス軟骨細胞で発現に差異がある遺伝子を同定する。(b)マウス関節軟骨初代培養細胞による軟骨分化に関わるシグナル経路の解析:軟骨分化のマーカー遺伝子であるII型コラーゲン、アグリカンの発現に関与することが報告されているWnt, TGF-β,BMP, FGF経路のシグナル関連分子に相違があるかどうかを定量PCR, ウェスタンブロット法を用いて解析する。 (2)野生型C3H10T1/2細胞及びTNX過剰発現C3H10T1/2細胞を用いて軟骨代謝機構を解析する。細胞増殖、アポトーシスの解析:野生型C3H10T1/2細胞及びTNX過剰発現 C3H10T1/2細胞に、BMP-2を添加し、軟骨細胞に分化させ、細胞増殖はMTTアッセイにより、アポトーシスが惹起されるかどうかはTUNEL法により解析する。

Report

(2 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • Research Products

    (8 results)

All 2023 2022

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 2 results) Presentation (5 results)

  • [Journal Article] Clinical and molecular delineation of classical-like Ehlers-Danlos syndrome through a comprehensive next-generation sequencing-based screening system.2023

    • Author(s)
      Yamaguchi T, Yamada K, Nagai S, Nishikubo T, Koitabashi N, Minami-Hori M, Matsushima M, Shibata Y, Ishiguro H, Sanai H, Fujikawa T, Takiguchi Y, Matsumoto KI, Kosho T.
    • Journal Title

      Front Genet

      Volume: 14 Pages: 1234804-1234804

    • DOI

      10.3389/fgene.2023.1234804

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] A method for simultaneous quantification of various collagens by using nano-liquid chromatography tandem mass spectrometry.2023

    • Author(s)
      Gong Ao, Yamada K, Takeshita H, Matsumoto K.
    • Journal Title

      Shimane Journal of Medical Science

      Volume: 40 Pages: 9-12

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] COL1A1 expression induced by overexpression of both a 15 amino acid peptide from the fibrinogen domain of tenascin X and integrin α11 in LX 2 cells.2022

    • Author(s)
      Ken-ichi Matsumoto, Kohei Kawakami, Kazuo Yamada, Haruo Takeshita.
    • Journal Title

      Molecular Medicine Report

      Volume: 26 Issue: 5 Pages: 330-330

    • DOI

      10.3892/mmr.2022.12846

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 細胞外マトリックス・テネイシンXの軟骨分化への関与2023

    • Author(s)
      山田和夫、川上浩平、竹下治男、松本健一.
    • Organizer
      第55回日本結合組織学会学術大会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] A simultaneous quantification method of collagens in LX-2 cell culture medium using nano-LC/MS/MS.2023

    • Author(s)
      Ao Gong, Kazuo Yamada, Haruo Takeshita, Ken-ichi Matsumoto.
    • Organizer
      第55回日本結合組織学会学術大会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 質量分析法を用いた LX-2細胞培養液中の各種コラーゲンの同時定量法の開発.2022

    • Author(s)
      Ao Gong, Kazuo Yamada, Haruo Takeshita, Ken-ichi Matsumoto.
    • Organizer
      第54回日本結合組織学会学術大会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] 類古典型エーラス・ダンロス症候群における分子遺伝学的・臨床的研究:アジア初のシリーズ.2022

    • Author(s)
      山口智美、山田和夫、松本健一、古庄知己
    • Organizer
      第3回日本エーラス・ダンロス症候群研究会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] A simultaneous quantification method of collagens by nano-liquid chromatography tandem mass spectrometry.2022

    • Author(s)
      Ao Gong, Kazuo Yamada, Haruo Takeshita, Ken-ichi Matsumoto.
    • Organizer
      第3回日本エーラス・ダンロス症候群研究会
    • Related Report
      2022 Research-status Report

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Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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