| Project/Area Number |
22K11763
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 59040:Nutrition science and health science-related
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
若林 あや子 日本医科大学, 医学部, 講師 (30328851)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
遠田 悦子 日本医科大学, 医学部, 教授 (00589327)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | 食品添加物 / ミョウバン / 抗生剤 / 小腸上皮細胞 / 細胞死 / ピロトーシス / IL-33 / 好酸球 / 腸内細菌叢 / アルミニウム含有食品添加物 / バチルス科細菌 / 腸上皮細胞 / 腸内細菌 / 炎症誘導 |
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| Outline of Research at the Start |
我々は、食品添加物ミョウバンを経口投与したマウスで、腸管の好酸球浸潤と腸上皮細胞死が亢進することを見いだした。マウスを抗生剤（アンピシリン、ネオマイシン、バンコマイシン、メトロニダゾール）で経口処置すると、ミョウバンによる腸上皮細胞死と好酸球浸潤は促進した。腸上皮細胞のRNAシーケンシングでは細菌に対する反応や細胞死に関わる遺伝子発現が増加していた。
本研究では、①ミョウバンによる腸内細菌の腸上皮細胞内侵入、②細胞内細菌による炎症性細胞死誘導、③dysbiosisでのミョウバン摂取による炎症性細胞死の亢進を明らかにする。食品添加物や腸内細菌による炎症誘導の解明は、腸管炎症の予防や緩和に繋がる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまで食品添加物アンモニウムミョウバン(AAS)が、抗生剤(アンピシリン、ネオマイシン、バンコマイシン、メトロニダゾール)処置したマウスの小腸上皮細胞(IEC)で重度の細胞死を引き起こすことを見出した。さらにIECのRNAシークエンス(RNA-seq)により、AASはIl33とCasp11遺伝子発現を増強し、抗生剤はCasp6およびNlrp6遺伝子発現を増強することを明らかにした。またマウス小腸内容物とIECの16S rRNA-seqの結果、抗生剤非処置マウスの小腸ではムリバキュラ科などのグラム陰性共生細菌が優勢であったが、抗生剤処置ではこれら共生菌が著しく減少し、グラム陽性のバチルス科細菌が優勢であった。
そこで本年度マウスIECのウエスタンブロット解析を行ったところ、AAS経口投与したIECではIL-33、IL-18、カスパーゼ-1の切断・活性化が観察された。ただし活性型カスパーゼ-11と切断型ガスダーミンD (GSDMD)は、抗生剤処置下にAAS投与したIECでのみ検出された。加えて抗生剤処置IECでは活性型カスパーゼ-6が増加した。さらにマウス小腸組織のヘマトキシリン・エオジン染色と好酸球顆粒染色を行ったところ、抗生剤処置下にAAS投与した十二指腸・空腸・回腸における好酸球浸潤の増加、および回腸における絨毛萎縮が認められた。
これらの結果は、抗生剤処置下のIECではカスパーゼ6活性化によるアポトーシスが起こることに加えて、AASの経口投与によりカスパーゼ-1・カスパーゼ-11・GSDMDの切断を介したピロトーシスと成熟IL-18・IL-33の放出が誘発される可能性を示す。従って食品添加物ミョウバンは、抗生剤処置によりディスバイオーシスを起こした腸管で重篤な上皮細胞死、成熟IL-33とIL-18分泌、好酸球浸潤によるアレルギー性炎症を引き起こす可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度、ウエスタンブロット解析により、AAS経口投与したIECではIL-33、IL-18、カスパーゼ-1が切断・活性化され、活性型カスパーゼ-11と切断型ガスダーミンD（GSDMD）は抗生剤処置下にAAS投与したIECでのみみられることが明らかになったことは大きな進展であった。加えて抗生剤処置下にAAS投与した十二指腸・空腸・回腸における好酸球浸潤の増加、および回腸における絨毛萎縮を観察したことも大変意義のある発見であった。
現在までの結果、抗生剤処置下のIECではAAS投与によりカスパーゼ-1、カスパーゼ-11、GSDMDの切断を介したピロトーシスと成熟IL-18・IL-33の放出が誘発され、腸管の好酸球浸潤を引き起こす可能性を示された。今年度の研究結果は、今後のさらなる研究の方向づけを明確にするものであった。引き続く世界的社会状況の影響により、一部の試薬や実験器具などの納入の遅延や入手困難となる事態はあったが、代わりとなる試薬や器具を使用するなどして対応した。研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究結果から、抗生剤処置はグラム陰性共生細菌を著しく減少させ、グラム陽性の抗生剤耐性バチルス科細菌優位なdysbiosis を引き起こすこと、こうした状態でAASはカスパーゼ-1、カスパーゼ-11、GSDMDの切断を介したピロトーシスと成熟IL-18・IL-33の放出が誘発され、腸管の好酸球浸潤を引き起こす可能性を示された。
そこで今後は、カスパーゼ-1阻害剤およびカスパーゼ-11阻害剤を用いて、GSDMD切断を介したピロトーシス・IL-33とIL-18の放出・腸管好酸球浸潤が抑制されるか否かを検討する。具体的には抗生剤処置したマウスへのAAS経口投与前にカスパーゼ-1阻害剤またはカスパーゼ-11阻害剤を注入し、腸上皮細胞におけるカスパーゼ-1・カスパーゼ-11・GSDMD・IL-33・IL-18の切断の変化、血清中IL-33・IL-18値の低下、腸管好酸球浸潤の減少の観察を試みる。
加えて、SV40-T抗原遺伝子を導入したマウス不死化小腸上皮細胞に、in vitroで抗生剤・AAS・グラム陽性細菌成分リポテイコ酸・グラム陰性細菌成分リポポリサッカロイドを暴露させ、AASが腸上皮細胞のエンドサイトーシス機能不全・リソソーム機能不全を引き起こして、リポテイコ酸などグラム陽性細菌成分の細胞質への曝露を促すかを明らかにする。加えて、細胞質リポテイコ酸によるインフラマソーム活性化、炎症性細胞死ピロトーシスとIL-33・IL-18分泌誘導について解析し、ミョウバンによる腸上皮バリアの損傷と消化管アレルギーの発症における腸内細菌の関与を明らかにする。消化管アレルギーの予防・治療・緩和の礎となるべく、本研究を推進する所存である。
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