Project/Area Number |
22K11867
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Section | 一般 |
Review Section |
Basic Section 59040:Nutrition science and health science-related
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Research Institution | Chubu University |
Principal Investigator |
青山 友佳 中部大学, 生命健康科学部, 准教授 (40460498)
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Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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Keywords | 先天性ケトン体代謝異常 / モノカルボン酸トランスポーター(MCT) / MCT1 / MCT4 / ケトン体代謝 / 遺伝子多型解析 / 先天代謝異常症 / 乳幼児突然死 / モノカルボン酸トランスポーター / 先天性ケトン体代謝異常症 / ケトン体 / 分子栄養学 |
Outline of Research at the Start |
乳幼児の突然死にも関わるケトン体代謝異常症の病態解析を進めるなかで、ミトコンドリア内のケトン体の作用機序が正常でも代謝異常が発生することがあった。この疑問を解決するため本研究では、細胞膜に存在し細胞内外のケトン体濃度を調整するモノカルボン酸トランスポーター(MCT)に着目し、ケトン体代謝に特に関わるMCT1、MCT4の遺伝子変異・一塩基多型の解析を行う。さらにMCT1、MCT4欠損モデル細胞の構築により、乳酸・ケトン体利用とミトコンドリアでの代謝異常への影響を評価する。これらの解析から、ケトン体代謝異常の重篤なケトアシドーシス発作の発見につながるバイオマーカーの確立につなげる。
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Outline of Annual Research Achievements |
先天性ケトン体代謝異常症は、乳幼児において重篤なケトアシドーシス発作を起こす遺伝性の希少疾患である。ミトコンドリア内のケトン体代謝異常が原因とされるが発症機構は不明な点が多く、乳幼児突然死の原因になる。本研究は、重篤なケトアシドーシス発作につながるケトン体代謝異常において、その重症度の差が生じる原因としての遺伝子変異や一塩基多型が及ぼす、細胞膜とミトコンドリアにおける代謝経路でのケトン体利用の機序を解明することを目標としている。今年度は、ケトン体代謝異常症ではまだ未解明な細胞膜上のトランスポーターであるMCT1、MCT4について、遺伝子多型、タンパクの機能、ケトン体の作用機序について総合的にアプローチするための実験系を構築するため、下記の実験を進めた。 ①MCT1・MCT4における遺伝子解析:MCT1をコードするSLC16A1、MCT4をコードするSLC16A3遺伝子にて、各エクソンを増幅するためのプライマーの設計、遺伝子解析の条件を確立した。これら遺伝子の一塩基多型の解析を進めるにあたり低侵襲の採血が望ましいと考え、血液ろ紙への微量採血にて乾燥血液ろ紙からのDNA抽出法を確立した。 ②MCT1・MCT4の抽出とウエスタンブロット解析:MCT1、MCT4蛋白を得るため細胞質タンパクのコンタミネーションを抑える抽出試薬および抗体の検討を行い、ウエスタンブロットによるMCT1、MCT4蛋白の評価が可能となった。β-ケトチオラーゼ欠損症、SCOT欠損症とともにケトン体利用障害の総合的な評価につながる。 ③MCT1を介した乳酸の代謝とミトコンドリアでのエネルギー代謝評価:MCT1欠損細胞の細胞培養液を低グルコース環境とした条件での乳酸の取り込みとミトコンドリアでのエネルギー産生の代謝解析を行なった。MCT1欠損細胞は野生型細胞と比較し、細胞内外の乳酸濃度が高値であることが明らかとなった。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の計画としていた①MCT1・MCT4遺伝子解析、②MCT1・MCT4を評価するためのウエスタンブロット解析、③MCT1欠損細胞を用いた乳酸の代謝とミトコンドリアでのエネルギー代謝評価について、当初の予定通り進めることができた。
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Strategy for Future Research Activity |
当初より計画している課題について、下記のように進めていきたい。 (1)MCT4欠損細胞株による乳酸代謝とミトコンドリアのエネルギー代謝解析: MCT4欠損細胞株を樹立しエネルギー代謝解析を進める。MCT1欠損細胞株によるエネルギー代謝解析の結果をふまえこの2つのトランスポーターでの代謝の違いを評価する。 (2) MCT1、MCT4欠損細胞株におけるケトン体代謝解析: MCT1、MCT4欠損細胞株を低グルコース条件の培養液にケトン体を添加し、その取り込みとミトコンドリアでのATP活性を評価する。2つのトランスポーターでのケトン体代謝の違いを評価する。 (3) MCT1、MCT4における一塩基多型の解析: SLC16A1のrs1049434、SLC16A3のrs368788465についてリアルタイムPCRの条件検討を行い、MCT1およびMCT4におけるSNP解析を確立する。
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