| Project/Area Number |
22K12374
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 63020:Radiation influence-related
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
津田 雅貴 国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 室長 (00734104)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | DNA二本鎖切断 / DNA double-strand break |
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| Outline of Research at the Start |
放射線は、DNA二本鎖切断（DSB）を誘発しゲノムDNAに重篤な損傷を与える。これまでに、多くの先行研究により放射線誘発DSBの修復機構の詳細が明らかにされた。一方、抗がん剤として使われる放射線類似作用物質もDSBを生成することが知られており、その修復機構は放射線誘発DSBと同じと考えられている。本研究では、放射線および放射線類似作用物質が誘発するDSBの修復経路の違いを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
トポイソメラーゼ1(TOP1)やトポイソメラーゼ2(TOP2)は、転写(遺伝子発現)やDNA複製の際に生じるDNAの超らせん構造を解消するために必須の酵素である。TOP1は一過的にDNA1本鎖切断、TOP2はDNA2本鎖切断を発生させることで超らせんを解消する。TOP1は反応中間体として、DNAの3'切断端と活性部位のチロシン残基が共有結合した複合体(TOP1 covalent complex: TOP1cc)を形成する。一方、TOP2はDNAの5'切断端と活性 部位のチロシン残基が共有結合した複合体(TOP2 covalent complex: TOP2cc)を形成する。Tyrosyl-DNA phosphodiesterase (TDP) 1は、DNAのねじれを解消する酵素であるトポイソメラーゼ(TOP)1がDNAの3'リン酸末端に不可逆的にトラップされた反応中間体を除去する酵素である。一方、TDP2は、TOP2がDNAの5'リン 酸末端に不可逆的にトラップされた反応中間体を除去する酵素である。2023年度は、3'末端に生成する様々なDNA損傷の除去に、TDP２が関与していることを明らかにした。さらに、その触媒機構も明らかにし、Journal of Biological Chemistry誌に発表することができた。さらに、TDP2が放射線類似作用物質が作るDNA二本鎖切断の修復に関与することも明らかにした。その際、DNA二本鎖切断の修復動態を中性コメットアッセイを用いて明らかにした。現在、本研究成果に関して論文を作成している段階である。また、現在、TDP2の基質特異性を生化学的解析を用いて分析している段階であり、将来的には、遺伝学的解析と生化学的解析を組み合わせることで、統合的な解析を行なっていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで、TK6細胞のTDP2遺伝子を破壊した細胞や、TDP1遺伝子を破壊した細胞を用いて、放射線類似作用物質に対する感受性やDNA二本鎖切断修復の動態を調べてきた。その結果、TDP1遺伝子欠損細胞では優位にDNA二本鎖切断の修復が遅延した。さらに、TDP1/TDP2二重遺伝子破壊細胞においては、TDP1遺伝子欠損細胞やTDP2遺伝子欠損細胞に比べて、より顕著なDNA二本鎖切断修復の低下が見られた。これは、細胞内においてTDP2が、放射線類似作用物質が生成するDNA二本鎖切断修復に関与することを意味する。本年度は、同様に、これらの細胞を用いて、放射線に対するDNA二本鎖切断修復への貢献を調べた。その際、野生型細胞、TDP1遺伝子欠損細胞、TDP2遺伝子欠損細胞、TDP1/TDP2二重遺伝子欠損細胞を用いた。TDP1遺伝子欠損細胞では、わずかではあるが、放射線に対するDNA二本鎖切断の修復が遅延した。さらに、TDP1/TDP2二重遺伝子欠損細胞では、TDP1遺伝子欠損細胞やTDP2遺伝子欠損に比べて、優位なDNA二本鎖切断の修復の遅延は見られなかった。これらの結果は、放射線が作るDNA二本鎖切断の修復には、TDP1が貢献することを示す。しかし、その貢献は、放射線類似作用を暴露した際に生成するDNA二本鎖切断の修復よりは貢献しない。これは、放射線および放射線類似作用物質が作るDNA二本鎖切断の性状が異なることを意味する。さらに、TDP2は、放射線が生成するDNA二本鎖切断の修復には、ほとんど関与しないことを意味する。また、TDP2は、TDP1の存在しない時において、放射線類似作用物質が生成するDNA二本鎖切断の修復に大きく貢献していることを意味する。
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| Strategy for Future Research Activity |
2023年度は、TDP1が存在しない時に、TDP2が放射線類似作用物質が生成するDNA二本鎖切断の修復に貢献することを細胞レベルで明らかにできた。しかし、細胞内でTDP2が放射線類似作用物質が作るDNA二本鎖切断の修復における触媒機構は不明である。そこで、2024年度は、TDP2の触媒活性において、重要なグルタミン酸152をグルタミンに置換した細胞を作製する(TDP2 E152Q/E152Q細胞)。作製方法は、TDP2遺伝子を標的とするターゲティングベクター（ピューロマイシンおよびネオマイシン耐性遺伝子を保有）のアームにグルタミン152がかかるように設計する。また、CRISPR/Cas9システムを用いて、標的組換えを起こさせるので、gRNAを発現するベクターも作製する。これらのベクターを同時に、野生型細胞およびTDP1遺伝子欠損細胞に、エレクトロポレーションで導入する。その後、ピュートマイシンとネオマイシンを同時処理し、シングルコロニーを取得する。得られたコロニーが標的組換えを起こしているかをゲノミックPCRを用いて調べる。目的の細胞を得た後は、TDP2遺伝子領域内に挿入されているピューロマイシンおよびネオマイシン耐性遺伝子をCREを発現させることで、取り除く。これらの薬剤耐性が除去された細胞のTDP2のmRNAを調べ、E152Q点変異が入っているかを調べる。
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