Whole-genome sequence analysis of radiation-induced mutations in human hematopoietic stem cells
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22K12388
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 63020:Radiation influence-related
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| Research Institution | Radiation Effects Research Foundation |
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Principal Investigator |
田邉 修 公益財団法人放射線影響研究所, バイオサンプル研究センター, センター長 (70221398)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松田 由喜子 公益財団法人放射線影響研究所, 分子生物科学部, 研究員 (10735301)
内村 有邦 公益財団法人放射線影響研究所, 分子生物科学部, 室長 (20513063)
吉田 健吾 公益財団法人放射線影響研究所, 分子生物科学部, 室長 (70443596)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥260,000 (Direct Cost: ¥200,000、Indirect Cost: ¥60,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | DNA損傷 / 体細胞変異 / 変異シグネチャー / バイオドシメトリ / 晩発障害 / 悪性腫瘍 / クローン化 / 老化 |
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| Outline of Research at the Start |
原爆被爆者には放射線被ばくによって、ガンなどの病気が増加することが知られているが、その仕組みは明らかになっていない。この研究では、一般人と原爆被爆者から提供を受けた血液から、血液細胞の元となる造血幹細胞を一個ずつ単離して増殖させた後にDNAを抽出し、その塩基配列を分析することにより、1個の造血幹細胞に生涯に蓄積した変異をできる限り多く見つける。その結果の分析により、原爆放射線への被ばくにより生じた変異の数、種類などの特徴を明らかにすることにより、放射線被ばくによるガンなどの病気の増加の仕組みを明らかにするとともに、個人が生涯に被ばくした放射線の量を推定する方法の開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、放射線被曝の晩発障害の分子メカニズムを明らかにすることと、放射線に特異的な体細胞変異シグネチャーを同定して新しいバイオドシメトリの開発へ応用すること、の二つである。原爆被爆者には、放射線被曝の晩発障害として悪性腫瘍や循環器疾患などの過剰リスクが観察されているが、その分子メカニズムは未解明である。このため本研究では、放射線被曝による体細胞変異に着目し、ボランティア及び原爆被爆者の造血幹細胞における体細胞変異を全ゲノム規模で分析し、生涯に蓄積した体細胞変異の種類、頻度、特徴を明らかにする。そして、これらと被曝線量との関連を分析する。始めにボランティア試料を用いた、以下に記す予備的研究を行って、実験方法及びデータ解析方法を最適化した後に、被爆者試料を用いた研究を実施する。ボランティアの血液試料より単核球を分離し、セルソーターを用いて造血幹細胞を単離して分化増殖させて細胞クローンを得る。これら造血幹細胞由来クローンと分画前のバルク単核球試料からDNAを抽出して、全ゲノムシーケンス解析を行う。単核球試料では検出されず、造血幹細胞由来クローンのみに検出される変異を、体細胞変異と定義する。これらのデータをもとに塩基置換、欠失、挿入、構造変異などの体細胞変異をボランティア試料で分析することにより、造血幹細胞における自然発生の体細胞変異の種類、頻度、特徴とそれらの個人差を明らかにする。本研究は、ヒトゲノム解析研究であり、国の研究倫理指針を遵守して行う必要があるため、令和4年度には、詳細な研究計画書と説明同意文書を作成して倫理審査委員会の承認を得た。また、造血幹細胞の単離・培養などの実験条件や、データ解析条件などの最適化のための予備的研究を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
以下に記す研究計画に対する現在の進捗状況から、やや遅れていると評価される。本研究では、ボランティアの血液試料と、推定被曝線量2 Gy以上と5 mGy以下の被爆者の凍結保存された単核球試料より、セルソーターを用いて造血幹細胞を単離して半固形培地上で各種サイトカインを添加して分化増殖させて細胞クローンを得る。これら造血幹細胞由来クローンと分画前のバルク単核球試料からDNAを抽出して全ゲノムシーケンス解析を行う。単核球試料では検出されず、造血幹細胞由来クローンのみに検出される変異を、体細胞変異と定義する。始めに、ボランティアと線量5 mGy以下の被爆者のデータより、造血幹細胞における自然発生の体細胞変異の種類、頻度、特徴とそれらの個人差を明らかにする。次に、線量2 Gy以上の被爆者からのデータより、線量に応じた変異頻度の増加や、放射線に特異的な変異シグネチャーの有無を明らかにして、放射線誘発体細胞変異の特徴を明らかにする。
本研究は、ボランティア及び原爆被爆者から提供された血液試料を用いたヒトゲノム解析研究であるため、国の定める「人を対象とする生命科学・医学系研究に関する倫理指針」を遵守して行う必要がある。このため、令和4年度には、研究対象者への説明と同意取得、採血、血液試料の調製・保管、造血幹細胞の単離・培養、DNA抽出、全ゲノムシーケンス解析データの分析などの各作業工程の担当者からなる研究チームを組織して十分な打合せを行い、詳細な作業工程を記載した研究計画書と説明同意文書を作成し、倫理審査委員会の承認を得た。また、セルソーターを用いた造血幹細胞の単離・培養やDNA抽出などの実験条件の最適化や、全ゲノムシーケンス解析データの分析条件の最適化などの予備的研究を行った。これらに当初計画よりも時間を要したことが理由である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策
今後は放射線被曝による体細胞変異の頻度と特徴に関する研究を以下の通り推進する。
1）造血幹細胞のクローン化： ボランティア2人より血液試料の提供を受けて、単核球を分離して研究に使用する。また、単核球試料が放射線影響研究所に凍結保存されている被爆者のうち、推定被曝線量2 Gy以上の5人と、低線量被曝（5 mGy以下）の2人を選択し、その試料を研究に使用する。これら単核球試料より、セルソーターを用いて造血幹細胞を単離する。ウェル内に単離した造血幹細胞を半固形培地上で分化増殖させて50万個以上の細胞からなるクローンを取得する。
2）体細胞変異の同定と検証： 各試料提供者1人あたり少なくとも2個の造血幹細胞由来クローンと、分画する前のバルクの単核球試料の一部からDNAを抽出して、イルミナ・シーケンサーによる全ゲノムシーケンス解析を外部委託にて行う。これらのデータをもとに塩基置換、欠失、挿入、構造変異などの体細胞変異を検出、定量して、その特徴を分析する。この際、バルクの単核球試料の全ゲノムシーケンス解析の結果を生殖細胞系列の塩基配列と見なして、バルクの末梢血単核球では検出されず、いずれかのクローンのみに検出される変異を体細胞変異と定義してその後の解析対象とする。同定された体細胞変異の検証のために、各DNA試料よりPCRによって変異部分を増幅して高深度の標的シーケンス解析を行う。
3）体細胞変異への放射線影響の解析： 始めにボランティアと低被曝線量の被爆者からのデータの解析により、ヒト造血幹細胞における自然発生の体細胞変異の種類、頻度、特徴とそれらの個人差を明らかにする。次に、推定被曝線量2 Gy以上の被爆者からのデータの分析により、線量に応じた変異頻度の増加や、放射線被曝に特異的な変異シグネチャーの有無を明らかにして、ヒト体細胞における放射線誘発変異の特徴を明らかにする。
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Report
(1 results)
Research Products
(3 results)
