| Project/Area Number |
22K12388
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 63020:Radiation influence-related
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| Research Institution | Radiation Effects Research Foundation |
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Principal Investigator |
田邉 修 公益財団法人放射線影響研究所, バイオサンプル研究センター, センター長 (70221398)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松田 由喜子 公益財団法人放射線影響研究所, 分子生物科学部, 研究員 (10735301)
内村 有邦 公益財団法人放射線影響研究所, 分子生物科学部, 副部長 (20513063)
吉田 健吾 公益財団法人放射線影響研究所, 分子生物科学部, 副部長 (70443596)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥260,000 (Direct Cost: ¥200,000、Indirect Cost: ¥60,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | DNA損傷 / 体細胞変異 / 変異シグネチャー / バイオドシメトリ / 晩発障害 / 悪性腫瘍 / クローン化 / 老化 |
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| Outline of Research at the Start |
原爆被爆者には放射線被ばくによって、ガンなどの病気が増加することが知られているが、その仕組みは明らかになっていない。この研究では、一般人と原爆被爆者から提供を受けた血液から、血液細胞の元となる造血幹細胞を一個ずつ単離して増殖させた後にDNAを抽出し、その塩基配列を分析することにより、1個の造血幹細胞に生涯に蓄積した変異をできる限り多く見つける。その結果の分析により、原爆放射線への被ばくにより生じた変異の数、種類などの特徴を明らかにすることにより、放射線被ばくによるガンなどの病気の増加の仕組みを明らかにするとともに、個人が生涯に被ばくした放射線の量を推定する方法の開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、放射線晩発障害の機序を解明すること、そして放射線による体細胞変異シグネチャーを同定して新たなバイオドシメトリを開発することである。原爆被爆者に観察される悪性腫瘍の過剰リスクの原因として、放射線により誘発される体細胞変異の関与が示唆されているが、その機序は不明である。本研究では、一般ボランティア及び被爆者の造血幹/前駆細胞における体細胞変異を全ゲノム規模で同定して被曝線量との関連を分析する。方法としては、末梢血単核球より造血幹/前駆細胞を単離して分化増殖させてクローン化する。これらクローン化細胞とバルクの単核球試料から抽出したDNAの全ゲノムシーケンス解析により変異を同定する。これらの変異のうち、アレル比率がクローン化細胞で高く、バルク試料で低い変異を体細胞変異と判断する。これらの解析結果から、造血幹/前駆細胞における様々な体細胞変異の頻度及び特徴と被曝線量との関係を明らかにする。令和6年度までに、ボランティアの血液から造血幹/前駆細胞を単離してクローン化する手法を確立した。単離された造血幹/前駆細胞は、半固形培地上での培養により十分な増殖能を示し、全ゲノムシーケンス解析に必要なDNA量（1μg）が抽出可能であった。また、放射線影響研究所（放影研）は長年原爆被爆者の健診を行い、その際に提供された単核球試料を液体窒素タンク内で凍結保存しており、その数は約9千人分に達する。被爆時年齢が15-20才で、1990-1995年（被爆45-50年後）の間に単核球試料が凍結保存された受診者のうち、推定被曝線量2Gy以上の5名と、5mGy以下の2名を選択して分析対象とする。なお、抗癌剤や放射線などによる治療が体細胞変異頻度に影響する可能性があるため、試料提供前に悪性腫瘍などの既往のある受診者の試料は分析対象としない。これらを考慮して対象試料を選択するためのアルゴリズムを作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和6年度に、ボランティア3名の血液から密度勾配遠心により単核球を分離し、液体窒素中で4-28日間凍結保存後に、セルソーターにより分化マーカー陰性/CD34陽性/CD38陰性などで定義される造血幹/前駆細胞を単離した。血液1mLから平均190万個の単核球が分離され、単核球100万個あたり平均180個の造血幹/前駆細胞が検出された。このうち1名からは、20年前に凍結保存された単核球試料からも造血幹/前駆細胞を単離することに成功した。その数は単核球100万個あたり360個で、短期の保存試料と同等以上であり、長年凍結保存されている被爆者の試料が、この研究に使用可能であることが示唆された。これらの造血幹/前駆細胞の半固形培地上での培養により、細胞100万個以上からなるクローンが取得された。各ボランティアあたり2個の造血幹/前駆細胞由来クローンと、バルクの単核球試料からDNAを抽出した。また、放影研が長年液体窒素中に保管している膨大な数の単核球試料の中から被爆時年齢、推定被曝線量、既往歴などに基づいて対象試料を選択するためのアルゴリズムを作成した。
一方、本研究はヒトゲノム解析研究であるため、国の定めた「人を対象とする生命科学・医学系研究に関する倫理指針」を遵守して行う必要がある。そのため、令和5年度には、全ゲノムシーケンス解析に関する研究計画書と説明同意文書を作成して研究所内の研究計画審査を受けた。さらに令和6年度には、これら研究計画書と説明同意文書の倫理審査委員会による審査を受けて承認を得た。また上記の通り、造血幹/前駆細胞の単離とクローン化培養などの実験条件の最適化を行うとともに、対象試料を選択するためのアルゴリズムを作成した。これらに当初計画よりも時間を要したことが、進捗状況にやや遅れがある理由である。
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| Strategy for Future Research Activity |
進捗状況としてはやや遅れがあるものの、これまでのところ計画通りの研究成果が得られている。令和7度にはボランティアに加え、原爆被爆者を対象とした分析を行う。
1）造血幹/前駆細胞のクローン化とDNA抽出：単核球試料が凍結保存されている被爆者のうち、推定被曝線量2Gy以上の5名と、低線量被曝（5mGy以下）の2名を、令和6年度に作成したアルゴリズムを用いて選択する。これら分析対象者の保存単核球試料から、令和6年度までに確立した手法により造血幹/前駆細胞を単離し、半固形培地上で分化増殖させて細胞100万個以上からなるクローンを取得する。1人あたり2個の造血幹/前駆細胞由来クローンと、バルクの単核球試料からDNAを抽出する。
2）体細胞変異の同定と検証：被爆者計7名から得られた計21のDNA試料と、令和6年度にボランティア3名から得た計9のDNA試料との合計30試料の、イルミナシーケンサによる全ゲノムシーケンス解析を外部委託にて行う。シーケンス解結果と参照ゲノムシーケンスとの比較により変異を同定し、そのアレル比率が造血幹/前駆細胞由来クローンで高く、バルク試料で低い変異を体細胞変異と判断する。これらのデータをもとに塩基置換、欠失、挿入、構造変異などの体細胞変異を同定し、その頻度と特徴を分析する。同定された体細胞変異の検証のために、各DNA試料よりPCRによって変異部分を増幅して標的シーケンス解析を行う。
3）体細胞変異への放射線影響の解析：まずボランティアと低被曝線量の被爆者からのデータの解析により、ヒト造血幹/前駆細胞における自然発生の体細胞変異の種類、頻度、特徴とそれらの個人差を明らかにする。次に、被曝線量2Gy以上の被爆者からのデータの分析により、線量に応じた変異頻度の増加や、放射線被曝に特異的な変異シグネチャーの有無を明らかにして、ヒト造血幹/前駆細胞における放射線誘発変異の特徴を明らかにする。
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