高塩素置換型ポリ塩化ビフェニル類の還元的脱塩素化を大気下で実現させる

Research Project

Project/Area Number	22K12427
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 64020:Environmental load reduction and remediation-related
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	高塚由美子京都大学, エネルギー理工学研究所, 特定准教授 (70570810)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	原富次郎京都大学, エネルギー理工学研究所, 特定教授 (70616193)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	ポリ塩化ビフェニル類 / 還元的脱塩素化酵素 / 遺伝子組換え細菌 / ビタミンB12 / Dehalococcoides / 網羅的細菌叢解析 / 網羅的細菌叢メタゲノム解析 / ポリ塩化ビフェニル
Outline of Research at the Start	ポリ塩化ビフェニル類（PCBs）の微生物利用環境浄化技術への活用が望まれる「高塩素置換型PCBsの還元的脱塩素化反応」を、人為的にさらに「大気下で」実現する革新的生物触媒の創出を目的に、遺伝子組換え酵素によるPCBs脱塩素反応に必要な因子及び至適反応条件を探索し、さらに嫌気下で活性を示した組換え酵素に金属結合型補酵素を取り込ませた新機能酵素の創生を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	ポリ塩化ビフェニル類（PCBs）は難分解性の環境汚染物質で、世界に数多い汚染した土壌や河川等の有効な浄化法が希求されている。自然界でのPCBs微生物分解には「好気下での酸化的ビフェニル環開裂」と、反応条件が厳しく実利が困難とされる「嫌気下での還元的脱塩素化」が知られる。本研究は、微生物利用環境浄化技術に資する「高塩素置換型PCBsの還元的脱塩素化反応」を人為的に、さらに「大気下で」実現する革新的生物触媒の創出を目的とし、昨年度は、組換え酵素による高塩素置換型PCBsの人為的な脱塩素反応の達成に重点を置いた調査を、嫌気的雰囲気下のモデル実験、及び汚染原位置地下水中の細菌叢網羅的解析の二面より行った。データに正確を期すため、当該年度も上記２つの調査を継続して実施した。偏性嫌気性細菌のPCBs還元的脱塩素酵素については、組換え酵素の報告がまだ無く、我々も唯一の遺伝子同定報告があるデハロコッコイデス属細菌のPCBs脱塩素酵素をモチーフに組換え酵素発現株を作製したが、まだPCBs脱塩素反応を検出できない。至適反応条件調査のために構築した嫌気的雰囲気下のモデル実験では、PCBs汚染原位置から採取した地下水に意図的に添加したPCBsの緩やかな減衰を認め、且つPCBs脱塩素化細菌として報告がある３種属を検出しており、長期的変化を継続解析中である。また、組換え酵素の選択候補とPCBs脱塩素化現象の情報を広く得たいと考え、昨年度10月に実施した汚染原位置地下水中の細菌叢網羅的解析について年月や季節による変動がないかを調べるため、当該年度は６月及び１月の採水試料を使用して２回実施した。１月のデータは現在解析中であるが、６月採水試料の結果については、昨年度10月と比較して存在比率に若干の変動があったものの、PCBs脱塩素化細菌として報告がある３種属と新たな候補可能性種属が昨年同様に検出された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当該年度は「PCBs汚染原位置地下水を用いた脱塩素反応の至適条件調査」について、昨年度から継続実施し、人為的な嫌気的モデルでの反応試験や汚染原位置地下水中の網羅的細菌叢メタゲノム解析による再現性の確認など、おおむね計画通りに進んだ。これまでに嫌気的モデルでは、30 mg/Lの初期濃度で添加したPCBsの緩やかな減衰を繰り返し確認でき、同モデル中からPCBs脱塩素化の報告がある細菌３種属を検出した。また、本モデルの構築に使用している汚染原位置地下水中の網羅的細菌叢メタゲノム解析からも、上記３種属のPCBs脱塩素化細菌が同様に検出されており、昨年度10月及び当該年度６月と半年以上を経ても、存在比率に若干の変動があるものの、再現性良く検出されることが今回明らかとなった。現在解析中の当該年度１月採水試料のメタゲノム解析結果から、年月および季節による変動を含めた再現性について、さらに情報が得られるものと考えている。嫌気的モデルでのPCBsの緩やかな減衰は、検出した３種属のPCBs脱塩素化細菌によるものであろうと推測しているが、網羅的細菌叢解析で存在が示唆されている新たな種属についても興味深い。組換え酵素作製の候補として、PCBs脱塩素酵素の情報取得を試みたい。一方で、水酸化PCBsを脱塩素化する細菌の存在が示唆されたことから、昨年度より継続して試みている水酸化PCBsの分析については、コロナ禍及び国際情勢の影響に起因する分析依頼機関での対応が改善せずに中断している。現在、代替法を含めて他の分析機関なども検討しているが、近年の社会情勢等から分析価格も上昇しており、困難な状況である。分析試料数を限るなどの対応を考慮しつつ、引き続き本PCBs脱塩素化機構についての調査も試みたい。
Strategy for Future Research Activity	当該年度までは（１）組換え酵素による高塩素置換型PCBsの人為的な脱塩素反応の達成に重点を置き、特に（１－２）PCBs汚染原位置地下水を用いた脱塩素反応の至適条件調査に注力してきた。継続している本調査の結果を次年度はまとめるとともに、得られた内容を（１－１）必要な因子の探索にも活かす。その上で（２）嫌気下でPCBs脱塩素活性を示した組換え酵素に、１価コバルトを安定再生できる特性を付与した新機能酵素の創生を目指す。（１－１）組換え酵素によるPCBs脱塩素反応に必要な因子の探索：既に構築しているデハロコッコイデス属PCBs脱塩素酵素の発現系に改良を加える。（１－２）でこれまでに得られた知見を踏まえながら、組換え型脱塩素化酵素の活性検出において数少ない成功例である塩素化エチレン類の脱塩素酵素などを参考にして、酵素高次構造や活性へ影響すると予想される多くの寄与因子、さらには酵素異種発現における宿主などについても検討する。（１－２）PCBs汚染原位置地下水を用いた脱塩素反応の至適条件調査：嫌気的モデルにおいて繰り返し確認できているPCBsの緩やかな減衰と脱塩素反応との関係を明らかにし、これまでの報告と並べて本研究のPCBs脱塩素化機構を構築するための重要な参考データに位置づける。また、嫌気的モデル及び網羅的細菌叢メタゲノム解析で再現性良く検出されている数種類のPCBs脱塩素化候補種属について、新たな組換え酵素の選択モデルになり得るか情報取得を試みる。（２）コバルトを安定再生できる特性を付与した新機能酵素の創生：１価コバルトを安定再生するため、活性中心付近に導入する低分子化合物の構造や、導入位置について検討する。