| Project/Area Number |
22K12443
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 64030:Environmental materials and recycle technology-related
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
原田 尚志 鳥取大学, 工学研究科, 准教授 (50640900)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 低炭素技術 / 海洋性珪藻 / イソプレノイド / ゲノム編集 / 代謝工学 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、独自技術である珪藻類多重遺伝子改変システムを活用し、珪藻細胞のイソプレノイド基本代謝経路改変を行うことにより、内在カロテノイド、医薬品中間体およびバイオ燃料等に利用可能な物質を生産モデル分子として、大量生産に向けた技術開発を目指す。研究期間内においては、① イソプレノイド基本代謝経路強化用多重遺伝子発現ベクター構築、② 内在イソプレノイドをモデル分子とした代謝経路改変評価、③ 異種有用イソプレノイド合成遺伝子導入による生産検討という３課題を実施して目的の達成を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに、イソプレノイド前駆体生産経路であるメバロン酸経路の律速因子と推定される3酵素（HMG-CoA合成酵素・HMG-CoA還元酵素・メバロン酸キナーゼ）、ならびにモデル化合物であるα-farnesene合成酵素の遺伝子カセットを含む基本代謝経路強化ベクターを4種構築し、これらを珪藻細胞に導入・選抜した約50株の形質転換株を得た。これらの珪藻株においてはAlcTPS1の発現が転写レベルで確認されたものの、通常の培養条件においては目的産物が検出されなかった。細胞当たりの生産量が低いと予想されたことから、通常の人工海水培地より窒素源、リン酸源、およびミネラルを強化した油脂生産珪藻株の培地組成を基に高密度培養培地の検討を行った。その結果、細胞数が通常培地の5倍以上に増加した。さらに、高密度培養した細胞を10倍濃縮後に生産培養を行う二段階生産培養を試みた。その結果、目的産物であるβ-ocimeneが微量ながら検出された。
次に、翻訳レベルでの細胞内局在および発現評価を行うため、AlcTPS1のC末端側にeGFPタグを融合した発現カセットを持つベクターの構築および珪藻株への導入を行った。獲得した形質転換珪藻株について蛍光顕微鏡観察による発現確認を行った結果、細胞質においてGFP蛍光が観察されたが、クローンによって発現量に差があること、培養過程で発現が維持されず退色が認められることから、生産培養中のさらなる生産量増加のためには合成酵素の高発現化や基質供給経路の強化など、細胞当たりの生産量を増加するための方策が必要であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
R5年度は多重遺伝子発現ベクター導入株による生産評価を行ったが、目的産物の生産には培地と培養条件の詳細な検討が必要であることが示され、当初の目的とは異なる方向に研究が進展したものの目的産物の検出に至ったことから、最終年度も概ね計画通りの進展が期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度においては、当初の目的である上流経路導入による基質供給強化の効果について評価を行う。また、独自のゲノム編集技術を用いた周辺代謝経路の遮断についても、次期計画の準備研究として進めていく予定である。
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