Improvement of the therapeutic apheresis and development of new therapeutic membranes for refractory connective tissue disease focusing on the elimination of extracellular vesicles

Research Project

Project/Area Number	22K12788
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 90110:Biomedical engineering-related
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	草生真規雄順天堂大学, 医学部, 准教授 (80534916)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	血漿交換 / アフェレシス / エクソソーム / 細胞外小胞
Outline of Research at the Start	血漿交換療法は、致命的な難治性膠原病に対しても有効性を示しうる治療である。しかし有効性発現に数週間を要する点について改善の余地が残る。そこで本研究では血漿交換療法の治療効率を改善することを目的に、血漿交換療法により広範に除去されると予備的に判明している細胞外小胞(Extracellular vesicles：EV)のなかで、炎症促進性のEVのみを弁別し選択的に除去することが可能であるとの仮説を立て、治療前後で除去されるEVのうち炎症促進性、抗炎症性のEVの割合と特性を明らかにする。本研究では、得られた成果より炎症性EVを選択的に除去する方法を開発し、世界初の技術革新の創出を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	なぜ致死的難治性膠原病に対し直接病因を除去しているはずの血漿交換療法は有効であるにしてもゆっくり効くのか？この問いに対し我々は、現状の血漿交換療法では病原因子を直接除去しているのみならず、炎症に対し保護的に働いている細胞外小胞（EV）等の因子も無分別に除去しているため効果が緩徐に発現するのみに留まるのではないか、EVのうち炎症促進性のものだけを血漿交換療法によって選択的に除去し、同時に存在している抗炎症作用をもつ抑制的EVについては末梢循環血液中に還流させることにより、現在の血漿交換の治療効果をさらに増強させることが出来るのではないか、という仮説を立てていた。このため本研究ではその実証に向け、１）難治性膠原病における血漿交換療法前後で除去されているEVのうち炎症促進性、抗炎症性のものの割合と特性を明らかにすること、２）このうち炎症促進性のEVのみを弁別し除去する手段を明らかにすることを全体の研究におけるロードマップとしていた。１）を達成する手段として、2022年（令和4年）度中には①血漿交換療法で分離された臨床検体において血漿中のEVは比重または粒子径により複数のサブグループへ分類ができるという証明を行おうとした。また、分類ができた段階で②分類したEVグループ別の特徴的表面分子マーカーについての解明を行うことを企図していた。しかし通常治療の一環として血漿交換療法がなされた全身性エリテマトーデス症例において、治療後に分離された臨床検体としての血漿からは豊富な量のEVを検出できたものの、それらは濃度勾配などで弁別できるような差異を保持しておらずフローサイトメトリーによっても大きさ別に分類することが困難であったことから①の実証はできなかった。今後単離したEV毎にプロテオーム解析を行い、さらに特徴的なサブグループに弁別することが可能であるかどうかについて検討を進めていく予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 研究を進めるに当たり前提としていた仮説に従い、血漿交換療法で分離された臨床検体において血漿中の細胞外小胞は比重または粒子径により複数のサブグループへ分類ができる、ということについて証明を行おうとしたが、全身性エリテマトーデスの血漿交換療法の際に得られた血漿検体中の細胞外小胞については、これまでに行った濃度勾配法またはフローサイトメトリーでは、サブグループに弁別できるような差異を確認することが出来ず、この実証については困難であった。前提となる仮説の証明に時間がかかっていることから、研究全体の進捗にやや遅れが生じている。
Strategy for Future Research Activity	今後の研究においては、細胞外小胞（EV）を単離あるいはごく少数の集団に分離したうえでＥＶ毎にプロテオーム解析を行い、特徴的なサブグループに弁別することが可能であるかどうかについての検討を進める。もし弁別することが可能となれば、さらに分類したEVグループ別の特徴的表面分子マーカーについての解明を行い、ひいてはそれらの特徴をもつＥＶが具体的にはグループ毎に実際に細胞において炎症性または抗炎症性といったように異なる反応性を示すのかどうか、THP-1細胞を用いてⅠ型インターフェロンやサイトカインプロファイルの変化の有無についてELISAまたはマルチプレックスサイトカインアッセイを用いた検討を行う。これによりそれぞれ弁別したEVサブグループのうちどの分画、表面分子マーカーを有する一群が炎症性または抗炎症性に作用するのかを明らかにする。こういった弁別により、どのEVグループが炎症性作用を持つのか、または保護的作用を持つのかが判明すれば、そのEVグループの特徴を捉えることで選択的に除去する治療への道が開ける。もしこれらのEVグループが特定の小粒子径を持つようであれば、既存で治療応用されている10～30nmのポアサイズをもち篩係数が異なる血漿分画器により選択的に分離・除去することが可能かどうかを明らかにする。また、もしこれらの炎症性EVグループが特定の表面マーカーを表出していると判明した場合には、既存で治療応用されているトリプトファンやフェニルアラニンといった疎水性アミノ酸をリガンドとした、あるいはポリマーコート吸着材をもちいた血漿成分吸着膜をもちいて、in vitroでこれらの炎症性EVグループが吸着材とコンタクトすることにより治療膜前後で吸着されているかどうかを明らかにする。うまく吸着ができていない場合には特徴となる表面分子マーカーを捉えうるような新規吸着剤の開発にも着手する。