| Project/Area Number |
22K12790
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 90110:Biomedical engineering-related
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| Research Institution | Tokyo Denki University |
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Principal Investigator |
矢口 俊之 東京電機大学, 理工学部, 教授 (70385483)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大越 康晴 東京電機大学, 理工学部, 教授 (10408643)
加藤 綾子 三条市立大学, 工学部, 教授 (30318159)
村松 和明 東京電機大学, 理工学部, 教授 (90408641)
住倉 博仁 東京電機大学, 理工学部, 准教授 (20433998)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | スフェロイド / 浮遊培養 / 水性二相系 / オルガノイド / 微小重力 |
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| Outline of Research at the Start |
臓器の再生や，臓器の構造を一部再現し，その機能を備えた細胞組織は，複数の種類の細胞からなる立体的集合体である．それを作製するには細胞を三次元的に配置，培養し，“三次元組織”として形成する必要がある．本研究では，水溶液でありながら"水と油"のように分離する水性二相系（Aqueous Two Phase System, ATPS）法を用い，細胞を高密度に培養液中に浮遊した状態で培養することで細胞凝集塊を形成することを目指す．また，それを部品としてブロックのように三次元的に組み立てて培養することでオルガノイドが構築可能かを検証し，その組織形成過程を解析して新たな知見を得る．
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| Outline of Annual Research Achievements |
臓器の再生や，臓器の構造を一部再現し，その機能を備えた細胞組織は複数の種類の細胞からなる立体的な細胞集合体である．それを作製するには細胞を三次元的に配置，培養し，“三次元組織”として形成する必要があるとされており，“ミニ臓器”であるオルガノイドの研究は多数行われている．しかし，細胞配置が本来の臓器が備える機能に与える影響については未解明な部分が大きい．また，その構築方法もラボベースでは多くの検討がなされているが大規模な生産方法は確立されていない．
本研究では，水溶液でありながら"水と油"のように分離する水性二相系（Aqueous Two Phase System, ATPS）を用い，細胞を培養液中に局所的高密度に浮遊した状態で培養することでスフェロイド形成を目指す．また，形成したスフェロイドを部品とし，ブロックのように三次元的に組み立てて立体的な組織として構築することで，新たなオルガノイド形成手法として検証し，さらにその組織形成の過程を解析することで新たな知見を得ることを目的とする．
計画初年度では，浮遊培養システムの新規試作を行い，それを用いたスフェロイドの試作を行った．また，ATPS培養液の基本特性評価として，分子量，濃度，混合比等について基礎検討を行った．浮遊培養システムについては細胞懸濁液滴を撮影した連続画像を解析することによりポンプシステムの制御を可能とした．計画2年目となる令和5年度ではシステムの改良を進め，それを用いて実際の細胞を用いたスフェロイド試作実験を行った．また，試作したスフェロイドについてサイズ分布等を評価・検討した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
試作したスフェロイド形成のためのバイオリアクターシステムでは，細胞懸濁液滴を一定の範囲に浮遊させるために液滴位置を画像的に自動認識し，その位置に応じた流量制御を行っている．しかし，その液滴はほぼ透明で形状も一定でないため，位置認識の精度向上が容易でなかったことにより研究計画に遅れが生じた．計画三年目では，画像の機械学習を用いた画像認識方法を用いることにより認識精度向上を検討してゆく．また，複数種類の細胞で形成が可能なこと，その各種細胞で構成されたスフェロイド同士をマージしてオルガノイドを形成可能なのことなどを示す．
試作したスフェロイド形成培養システムについては，培養液潅流の自動制御が改良中ではあるものの，スフェロイド試作を繰り返し行い，形成されるスフェロイドのサイズ分布について検討した．浮遊培養時間，細胞懸濁液滴濃度とその液滴量等の調整により，直径100～400μmのスフェロイドを一度に多数形成することが可能となった．ただし，スフェロイドのサイズ分布評価の結果，本方法では均一でばらつきの少ないサイズコントロールは困難であると判明した．今後はこの特徴をメリットとして活かせるような応用を検討する．
また，水性二相系培養液の時間安定性向上のための検討も行った．現在のところ5時間程度なら安定して二相を保っていたが，さらに長時間の培養では分離の平衡が保たれず，細胞懸濁液滴が崩壊する現象が確認されることがしばしば生じた．そこで，ATPS溶液の構成材料濃度を検討し，まだ再現性は高くないものの，12時間の浮遊培養を実現できた．引き続き，ATPSの組成（Polyethylene Glycol，Dextranの分子量および濃度），細胞懸濁濃度，潅流速度，流動状態（定常流，拍動流）等の条件の最適化を実験的に行う．
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| Strategy for Future Research Activity |
スフェロイド形成システムについては，再現性と安定した培養を行えるよう，特に細胞懸濁液滴の浮遊状態での画像認識による浮遊制御を改善する．また当初は広いサイズ範囲でのスフェロイド形成を考えていたが，サイズとしては直径数百マイクロメートル程度のスフェロイド形成に焦点を絞って培養条件の最適化を行う．これまでは基礎検討として繊維芽細胞でスフェロイド形成を行ってきたが，今後は他のスフェロイド研究でも多く用いられている細胞について本システムでのスフェロイド形成を行い，機能面での比較を行ってゆく．具体的にはヒト肝芽腫由来細胞（Hep G2）や，ヒト乳がん由来細胞（MCF-7）での検討を行う．その次のステップとして，形成したスフェロイドを三次元的に配置・培養することによりオルガノイド化の実現可能性とその過程を評価し，先行研究における結果と比較する．
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