cell free mRNAからの微量遺伝子変異検出法の確立とその応用
Project/Area Number |
22K12899
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Section | 一般 |
Review Section |
Basic Section 90140:Medical technology assessment-related
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Research Institution | National Institute of Health Sciences |
Principal Investigator |
築茂 由則 国立医薬品食品衛生研究所, 遺伝子医薬部, 主任研究官 (40469630)
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Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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Keywords | cfRNA / cfDNA / exosome / cell free RNA / コンパニオン診断 / がん / エクソソーム / EGFR |
Outline of Research at the Start |
cf-mRNAからの微量遺伝子変異の検出法は十分に確立されていない。本研究では、細胞の状態とcf-mRNA放出量、断片化レベルの評価、回収方法の検討、逆転写・増幅反応の至適化、二次構造や断片化レベルを考慮した変異検出プライマー、プローブ設計、検出方法・検出条件の検討など一連のプロセスを比較検討し、最適な検出方法を構築する。また、構築した検出系を臨床検体(肺がん患者由来の血漿)に適用し、日本人肺腺がんの主要な遺伝子変異(EGFR変異、KRAS変異)の検出感度・特異度についてcfDNA単独、cf-mRNA/cfDNA併用の比較検討を行い、cf-mRNAの有用性を明らかにする。
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Outline of Annual Research Achievements |
血中を循環するcell free DNA(cfDNA)に含まれる腫瘍由来の変異遺伝子の情報は、一部の進行がんへの投薬判定(コンパニオン診断)や再発モニタリングに利用されている。しかし、腫瘍由来のcfDNAが占める割合はごく僅かであり、感度不足の克服は継続的な課題となっている。 感度不足を補う方法として、最近では血中を循環するmRNA(cell free mRNA)の診断への利用が検討されている。しかし、cf-mRNAの存在様式(一本鎖、多様な塩基長、二次構造、細胞外小胞・極小顆粒内など)はcfDNAとは大きく異なり、検出・評価手法はまだ十分に確立されていない。本研究では、cf-mRNAの回収方法の検討、プライマー・プローブ設計の改良、逆転写・増幅酵素の比較検討、PCR条件の至適化など、cf-mRNAから微量遺伝子変異を検出するための一連のプロセスの最適化を行う。 今年度は、細胞外放出mRNAを効率的に回収するための方法に関する文献調査、高感度に検出する上で適切な酵素類(逆転写酵素,ポリメラーゼ)について調査を行い、最適と考えられる試薬類を選定した。また、プライマーの設計方法の調査と実際に設計されたプライマー群の品質についてSYBR green法にて確認を行い、最適なパフォーマンスが期待できるプライマーの選別方法を確立した。 上記と関連し、臨床検体から標的核酸配列を検出するための様々な核酸増幅検査薬に関して、それらの検出原理、逆転写酵素、ポリメラーゼ、内部標準核酸、検体処理方法、判定方法、試薬構成、測定機器など一連の調査研究を行い、その成果の一部について原著論文として医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス誌に報告した。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
培養上清を用いた検討まで着手するまでには至らなかったものの、概ね順調に進められており大きな問題はない。
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Strategy for Future Research Activity |
これまでの検討により、cfmRNAを検出するための試薬類の配備、最適化を進めることができた。今後は、ヒト肺がん細胞株の培養上清を用い、目的がん遺伝子変異の検出感度の評価を進める。
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Report
(1 results)
Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Survey and Consideration of the Composition of COVID-19 Diagnostic Nucleic Acid Amplification Tests Approved for Use in the Early Stage of COVID-19 Pandemic2023
Author(s)
築茂由則, 吉田徳幸, 大岡伸通, 内田恵理子, 山本真梨子, 野口耕司, 鈴木孝昌, 本間正充, 合田幸広, 井上貴雄
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Journal Title
Pharmaceutical and Medical Device Regulatory Science
Volume: 54
Issue: 2
Pages: 148-161
DOI
ISSN
1884-6076, 2436-6226
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Peer Reviewed
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