マルチオミックス解析を用いたヒトiPS細胞分化指向性制御機構の解明

• Project/Area Number: 22K12900
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 90140:Medical technology assessment-related
• Research Institution: National Institute of Health Sciences
• Principal Investigator: 黒田 拓也 国立医薬品食品衛生研究所, 再生・細胞医療製品部, 室長 (70648857)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: ヒトiPS細胞 / 分化指向性 / マルチオミックス解析 / iPS細胞

Outline of Research at the Start

ヒトiPS細胞は分化多能性を持つため、様々な細胞に分化することが可能である。しかしながら、神経や心筋など各種分化細胞への分化しやすさ(分化指向性)は細胞株ごとに異なることが明らかになっている。我々はこれまでの研究で、核内タンパク質であるSALL3の発現量が高い株は外胚葉に、発現量が低い株は中・内胚葉に分化しやすい性質を持ち、SALL3の発現量を比較することにより目的細胞に分化しやすい株を選択できることを報告している。本研究の目的は、これまで解明されていないSALL3によるプロモーター／エンハンサー領域における遺伝子発現制御機構を明らかにし、分化指向性の原因となるメカニズムを解明することである。

Outline of Annual Research Achievements

ヒトiPS細胞は分化多能性を持つため、様々な細胞に分化することが可能である。しかしながら、神経や心筋など各種分化細胞への分化しやすさ(分化指向性)は 細胞株ごとに異なることが明らかになっている。これまでの研究において、核内タンパク質であるSALL3がDNMT3Bに結合してGene body領域のDNAメチル化を調節することにより、 複数の転写因子の発現を制御し、ヒトiPS細胞の分化指向性に非常に重要な機能を持つことを明らかにしている。一方で、SALL3はプロモーター/エンハンサー領域にも多く結合しており、その領域でのSALL3の機能は未解明のままである。そこで本研究は、これまで解明されていない SALL3によるプロモーター/エンハンサー領域における遺伝子発現制御機構を明らかにすることにより、ヒトiPS細胞の分化指向性のメカニズムを解明することである。本年度は、WT株、SALL3 KO株の未分化状態 (Day0)におけるヒストン修飾をChIP-Seqにより解析した。具体的には、活性化型ヒストン修飾としてH3K27Ac、H3K4me1、HeK4me3について、抑制型ヒストン修飾としてH3K27me3、H3K9me1、H3K9me3の計6種類のChIP-Seq解析によりヒストン修飾を調べた。その結果、WT株とSALL3 KO株の間ではヒストン修飾に変化が見られた。これらの遺伝子の中にはiPS細胞の神経分化に関与する調節因子も含まれており、これらの遺伝子領域のヒストン修飾がヒトiPS細胞の分化指向性に寄与している可能性は高いと考えられる。来年度は、神経分化時における経時的、ヒストン修飾のChIP-Seq解析、ATAC-seq解析等のマルチオミックス解析を進めていく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

SALL3によるプロモーター/エンハンサー領域における遺伝子発現制御機構を明らかにすることを目的に、R5年度は、WT株とSALL3 KO株のヒストン修飾の比較解析を行った。まず、ヒストン修飾のChIP-Seq解析を行うために、hiPS細胞でChIP-Seqに使用できる抗体の評価を行った。その結果、活性化型ヒストン修飾としてH3K27Ac、H3K4me1、HeK4me3について、抑制型ヒストン修飾としてH3K27me3、H3K9me1、H3K9me3の計6種類のヒストン修飾の抗体がChIP-Seq解析に使用可能であることを確認した。評価した6種類のヒストン修飾について、まず初めに神経分化誘導前の未分化状態（Day0）でのChIP-Seq解析を行ったところ、WT株とSALL3 KO株の間で、神経分化や未分化維持に重要な転写因子のヒストン修飾に変化がみられた。これまでに行った、WT株、SALL3 KO株 の神経分化時(Day0, 3, 10)におけるマイクロアレイ解析結果と比較解析を行ったところ、未分化状態（Day0）ではこれらの遺伝子に発現量の有意な差は見出すことができなかった。以上の結果から、SALL3は神経分化や未分化維持に重要な転写因子のヒストン修飾を調節し、分化誘導開始前の分化開始前では殆どその発現量に影響しないことが示唆された。

Strategy for Future Research Activity

R6年度は、引き続き、神経分化過程における経時的（Day3, 10）なヒストン修飾解析をChIP-Seqを行うことにより進める。並行して、最初の実験で得られたSALL3 と物理的相互作用する転写因子について、WT株、SALL3 KO株(WTに比べ神経分化効率低下)を用いて神経分化時における経時的ChIP-Seq解析を行う。また、経時的なATAC-Seq解析を行い、遺伝子発現、ヒストン修飾、ATAC-Seqのデータを用いてマルチオミクス解析を通して、SALL3によるプロモーター/エンハンサー領域における遺伝子発現制御機構に重要な分子郡の同定を試み、SALL3を中心に神経分化における遺伝子発現制御機構を明らかにすることにより、分化指向性のメカニズムの解明を目指す。

Research Products

• [Journal Article] ROR2 expression predicts human induced pluripotent stem cell differentiation into neural stem/progenitor cells and GABAergic neurons (2024)
  • Author(s): Kuroda Takuya、Yasuda Satoshi、Matsuyama Satoko、Miura Takumi、Sawada Rumi、Matsuyama Akifumi、Yamamoto Yumiko、Morioka Masaki Suimye、Kawaji Hideya、Kasukawa Takeya、Itoh Masayoshi、Akutsu Hidenori、Kawai Jun、Sato Yoji
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 14 Issue: 1
  • DOI: 10.1038/s41598-023-51082-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Single-Cell RNA-Seq Reveals LRRC75A-Expressing Cell Population Involved in VEGF Secretion of Multipotent Mesenchymal Stromal/Stem Cells Under Ischemia (2023)
  • Author(s): Miura T, Kouno T, Takano M, Kuroda T, Yamamoto Y, Kusakawa S, Morioka MS, Sugawara T, Hirai T, Yasuda S, Sawada R, Matsuyama S, Kawaji H, Kasukawa T, Itoh M, Matsuyama A, Shin JW, Umezawa A, Kawai J, Sato Y.
  • Journal Title: Stem Cells Translational Medicine Volume: 12 Issue: 6 Pages: 379-390
  • DOI: 10.1093/stcltm/szad029
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 細胞加工製品の腫瘍形成リスクの合理的評価を目指して(1) (2023)
  • Author(s): 田中直子，阿部浩幸，荒木紀帆，石井匡，上野高嗣，黒田拓也，佐治大介，中村和靖，南保泰希，西田仁，坂東清子，藤田大樹, 松浦哲也, 三浦巧, 三木健次, 望月秀美, 安田智, 吉本将成, 渡辺夏巳, 佐藤陽治
  • Journal Title: 再生医療 Volume: 1 Pages: 30-35
• [Journal Article] Myocardial TRPC6-mediated Zn2+ influx induces beneficial positive inotropy through beta-adrenoreceptors. (2022)
  • Author(s): Oda S, Nishiyama K, Furumoto Y, Yamaguchi Y, Nishimura A, Tang X, Kato Y, Numaga-Tomita T, Kaneko T, Mangmool S, Kuroda T, Okubo R, Sanbo M, Hirabayashi M, Sato Y, Nakagawa Y, Kuwahara K, Nagata R, Iribe G, mori Y, Nishida M.
  • Journal Title: Nat Commun. Volume: 12 Issue: 1 Pages: 6374-6374
  • DOI: 10.1038/s41467-022-34194-9
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A single mutation in the E2 glycoprotein of hepatitis C virus broadens the claudin specificity for its infection (2022)
  • Author(s): Shirasago Yoshitaka、Fukazawa Hidesuke、Nagase Shotaro、Shimizu Yoshimi、Mizukami Tomoharu、Wakita Takaji、Suzuki Tetsuro、Tani Hideki、Kondoh Masuo、Kuroda Takuya、Yasuda Satoshi、Sato Yoji、Hanada Kentaro、Fukasawa Masayoshi
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 20243-20243
  • DOI: 10.1038/s41598-022-23824-3
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Single cell RNA sequencing as a new tool for identifying a cell subpopulation that contributes to a pharmacological effect of human mesenchymal stromal/stem cells. (2023)
  • Author(s): Miura T, Kouno T, Takano M, Kuroda T, Yamamoto Y, Kusakawa S, Morioka MS, Sugawara T, Hirai T, Yasuda S, Sawada R, Matsuyama S, Kawaji H, Kasukawa T, Itoh M, Matsuyama A, Shin JW, Umezawa A, Kawai J, Sato Y
  • Organizer: ISCT North America 2023 Houston Regional Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Identification of a predictive biomarker for the angiogenic potential of human mesenchymal stem cells by single cell-transcriptome analysis. (2023)
  • Author(s): Miura T, Kouno T, Takano M, Kuroda T, Yamamoto Y, Kusakawa S, Morioka MS, Sugawara T, Hirai T, Yasuda S, Sawada R, Matsuyama S, Kawaji H, Kasukawa T, Itoh M, Matsuyama A, Shin JW, Umezawa A, Kawai J, Sato Y
  • Organizer: ISSCR Vienna International Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] シングルセル解析によるヒト間葉系間質/幹細胞の特性指標探索の試み (2023)
  • Author(s): 三浦巧, 河野掌, 高野慈美, 黒田拓也, 山本由美子, 草川森士, 森岡勝樹, 菅原亨, 澤田留美, 松山さと子, 川路英哉, 粕川雄也, 伊藤昌可, 梅澤明弘, 河合純, 安田智, 佐藤陽治
  • Organizer: 第23回日本再生医療学会総会
• [Presentation] 単一細胞遺伝子発現解析による間葉系幹細胞の血管新生能予測バイオマーカーの探索 (2023)
  • Author(s): 三浦巧, 河野掌, 高野慈美, 黒田拓也, 山本由美子, 草川森士, 森岡勝樹, 菅原亨, 平井孝昌, 安田智, 澤田留美, 松山さと子, 川路英哉, 粕川雄也, 伊藤昌可, Jay W Shin, 梅澤明弘, 河合純, 佐藤陽治
  • Organizer: 第22回日本再生医療学会総会
• [Presentation] ヒトiPS細胞における神経分化予測マーカーによる神経分化調節機構の解明 (2023)
  • Author(s): 黒田拓也，安田智，松山さと子，三浦巧, 澤田留美，松山晃文，森岡勝樹, 粕川雄也, 山本由美子, 川路 英哉，伊藤昌可，阿久津英憲，河合純，佐藤陽治
  • Organizer: 第22回日本再生医療学会総会
• [Presentation] iPS細胞に感染できるC型肝炎ウイルス亜株の分離と性状解析 (2023)
  • Author(s): 水上智晴，白砂圭崇，深澤秀輔，長瀬翔太朗，清水芳実，脇田隆字，鈴木哲朗，谷英樹，近藤昌夫，黒田拓也，安田智，佐藤陽治，花田賢太郎，深澤征義
  • Organizer: 日本薬学会第143年会
• [Presentation] 間葉系幹細胞の薬理効果に寄与するバイオマーカーの効率的な同定法の開発 (2022)
  • Author(s): 三浦巧, 河野掌, 高野慈美, 黒田拓也, 山本由美子, 草川森士, 森岡勝樹, 菅原亨, 平井孝昌, 安田智, 澤田留美, 松山さと子, 川路英哉, 粕川雄也, 伊藤昌可, Jay W Shin, 梅澤明弘, 河合純, 佐藤陽治
  • Organizer: 日本再生医療学会第2回科学シンポジウム
• [Presentation] 神経細胞製造の原料としてのヒト多能性幹細胞の品質試験法の開発 (2022)
  • Author(s): 黒田拓也，安田智，松山さと子，三浦巧, 澤田留美，松山晃文，森岡勝樹, 粕川雄也, 山本由美子, 川路 英哉，伊藤昌可，阿久津英憲，河合純，佐藤陽治
  • Organizer: 日本再生医療学会第2回科学シンポジウム