| Project/Area Number |
22K14577
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 28040:Nanobioscience-related
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| Research Institution | Osaka University (2023)
Center for Novel Science Initatives, National Institutes of Natural Sciences (2022) |
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Principal Investigator |
西口 茂孝 大阪大学, 大学院工学研究科, 特任助教(常勤) (50873121)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | カドヘリン / 細胞間接着 / 一分子計測 / ダイナミクス / 高速AFM |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、高速原子間力顕微鏡 (高速AFM) と分子足場を用いた再構成手法を基盤技術として、細胞と細胞を繋ぐ細胞間接着タンパク質であるカドヘリンのクラスター形成過程および機械刺激と連動した結合構造の変換を、高速・高分解能 (0.3秒以下・2ナノメートル以下) で経時的に観察する手法を開発する。これにより、カドヘリンのクラスター形成機構および機械刺激による結合構造の制御機構の解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、細胞と細胞をつなぐ細胞間接着分子であるカドヘリンのクラスター形成メカニズムと、機械刺激によって誘起される構造変換メカニズムを、高速原子間力顕微鏡 (高速AFM) を用いた液中における分子の直接観察によって明らかにする。令和5年度は、研究計画調書のスケジュールに準じて、観察基板に展開した脂質膜に静電的に吸着したビオチン化アクチン線維に対して、モノマーストレプトアビジン (mSA2) 融合カドヘリンを固定化し、隣り合うアクチン線維間におけるカドヘリン複合体の形成を誘導することに取り組んだ。ビオチン化アクチン線維の再構成には成功したが、カドヘリンとmSA2の融合タンパク質では、カドヘリンの機能的活性 (カドヘリン同士が結合する活性) が消失することを確認した。そこで、カドヘリンとmSA2が適切な3次構造を保持し得るか検証するために、タンパク質の構造予測プログラムである、AlphaFold2 (AF2) を利用した結果、カドヘリンとmSA2の結合領域で立体障害が生じている可能性が示唆された。AF2で予測された立体障害を排除するために、カドヘリンとmSA2の境界に、フレキシブルリンカーとして知られるGGGGSのアミノ酸配列を3回繰り返した配列を導入した結果、カドヘリンの結合活性を保持した分子を作製することに成功し、高速AFMで作製した分子の適切な立体構造が保持されていることを確認した。一方で、令和4年度から取り組んでいたカドヘリンのクラスター形成機構の解明の検討の中で、CELSRカドヘリンのクラスター形成の観察に着手した結果、CELSRカドヘリンのダイマー間結合機構の解明に研究を展開し、得た成果をまとめた論文がPNAS誌に受理された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和5年度は、研究計画調書において当該年度の実施を予定していた、(4)-2. カドヘリン複合体の機械刺激応答特性の解析に主に取り組み、進捗状況は下記の通りである。
1. 観察基板に展開した脂質膜に静電的に吸着したビオチン化アクチン線維に対して、モノマーストレプトアビジン (mSA2) 融合カドヘリンを固定化し、隣り合うアクチン線維間におけるカドヘリン複合体の形成を誘導することに取り組んだ。ビオチン化アクチン線維の再構成には成功したが、カドヘリンとmSA2の融合タンパク質では、カドヘリンの機能的活性 (カドヘリン同士が結合する活性) が消失することを確認した。そこで、カドヘリンとmSA2が適切な3次構造を保持し得るか検証するために、タンパク質の構造予測プログラムである、AlphaFold2 (AF2) を利用した結果、カドヘリンとmSA2の結合領域で立体障害が生じている可能性が示唆された。AF2で予測された立体障害を排除するために、カドヘリンとmSA2の境界に、フレキシブルリンカーとして知られるGGGGSのアミノ酸配列を3回繰り返した配列を導入した結果、カドヘリンの結合活性を保持した分子を作製することに成功し、高速AFMで作製した分子の適切な立体構造が保持されていることを確認した。
2. 令和4年度から取り組んでいたカドヘリンのクラスター形成機構の解明の検討の中で、CELSRカドヘリンのクラスター形成の観察に着手した結果、CELSRカドヘリンのダイマー間結合機構の解明に研究を展開し、得た成果をまとめた論文がPNAS誌に受理された。
1において、カドヘリン-mSA2とビオチン化アクチン線維の結合に時間を要している状態ではあるものの、2のCELSRカドヘリンの結合機構解明の成果をふまえると、カドヘリンの結合機構の解明という目的においては、当該研究は順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度、令和5年度で得た成果の中で、E-cadherinのクラスター形成機構の解明に関する成果を論文としてまとめて投稿するために、令和6年度も本研究を継続する予定である。
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