Establishment of a novel deep 3D super-resolution observation method for living organisms by spatiotemporal fluorescence correlation analysis
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22K14578
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 28040:Nanobioscience-related
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| Research Institution | Center for Novel Science Initatives, National Institutes of Natural Sciences |
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Principal Investigator |
堤 元佐 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 特任助教 (60782422)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
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| Keywords | 蛍光顕微鏡 / 超解像顕微鏡 / 深部イメージング / ３次元超解像 / イメージング / 深部観察 / in vivo |
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| Outline of Research at the Start |
近年、蛍光顕微鏡技術の進歩により光の回折限界を超える「超解像観察」が可能となってきた。しかし、既存の超解像顕微鏡法は生体・組織深部観察への適用が困難であり、生命科学研究への適用に限界がある。申請者はこれまでの研究で、画像解析による超解像法SRRFと２光子顕微鏡法を組み合わせること（TP-SRRF）で生体深部の２次元平面において超解像観察が可能であることを見出した。本研究では、TP-SRRFの検証で得られた知見に基づき、２光子高速3次元イメージングにSRRFベースの３次元時空間蛍光相関解析を適用することで、汎用性の高い、新たな生体深部３次元超解像観察法を構築する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、既存の光学的アプローチによる超解像顕微鏡法では観察困難な、生体脳深部や腫瘍塊内部で生じる微細な生命現象の可視化を目指し、蛍光強度の空間・時間相関解析に基づく深部３次元超解像観察法の構築を目的とする。2022年度は当初計画通り、画像処理による超解像顕微鏡法SRRF（Super-Resolution Radial Fluctuations）の３次元拡張（3D-SRRF）に向けて、蛍光３次元イメージング法の洗練化と高速画像処理のための環境構築を進めた。
ニポウディスク式多点走査型２光子顕微鏡とピエゾ駆動Zステージを組み合わせ、マウス由来オルガノイドを対象に高速３次元イメージングの検討実験を行った。同観察では、数種類の高NA対物レンズによる観察を比較し、SRRF解析に十分なピクセルサイズを実現し、組織深部観察が可能な長作動距離型100倍シリコン浸対物レンズが本法の観察に適していることが確認された。同対物レンズを用いることで、数秒で細胞塊全体を3次元で画像取得可能だった。また、本研究に関連して２光子超解像観察に適した蛍光色素開発を共同研究で進め、今年度に成果論文が出版された。
SRRFの３次元拡張の取り組みに関して、本年度にSRRF法の原著者らがプレプリントとして発表した発展型SRRF（eSRRF、多焦平面顕微鏡像に対する3D-SRRF機能も含まれる）について、マウス固定脳スライスサンプルでのeSRRF観察を試した。その結果、微細形態の再現性が従来のSRRF法よりも改善していることが確認できた。一方で、我々が求める定量性を維持した超解像化の面では、従来のSRRF法の方が線形な処理を用いており優れていた。
さらに、3D-SRRF処理の高速化に必要な画像解析環境構築のため、SRRF処理に適した高速空間処理計算が可能な高性能GPUを搭載した解析PCを選定・カスタマイズし、導入した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上述の通り、当初研究計画に沿った形で顕微鏡観察側、画像解析側の環境構築が進んでおり、関連共同研究の成果論文を出版することができた。次年度には実サンプルでの3D-SRRFの実証観察に進める見込みである。
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| Strategy for Future Research Activity |
2023年度は当初計画通り、2022年度に構築した観察・解析環境を基に、3D-SRRFの実証実験を進める。実証に用いるサンプルについては既に細胞スフェロイドおよびマウス固定脳サンプルの準備は整っており、in vivoイメージングへの適用についても共同研究者と相談し、実施の目途が立っている。
3D-SRRF処理については、前年度のeSRRF法と比較した結果を踏まえて、より定量性の高い従来のSRRF法をベースとして改修し、用いる計画である。
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Report
(1 results)
Research Products
(3 results)
