| Project/Area Number |
22K14709
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 34020:Analytical chemistry-related
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
森岡 和大 東京薬科大学, 薬学部, 助教 (70794056)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | 楔形3Dマイクロチャネル / マイクロ流体デバイス / 3Dプリンティング / 粒子分離 / 粒子捕捉 / 楔型3Dマイクロチャネル / エクソソーム |
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| Outline of Research at the Start |
エクソソームは，膜タンパク質やマイクロ RNA などの情報を数多く内包しており，離れた細胞間のコミュニケーションツールとして機能する。エクソソームの研究では，内包する情報の「量」や「質（種類）」が活発に議論されている一方，細胞から放出されるエクソソームの「サイズ」と生体機能の関係については議論が進んでいない。
本研究では， 楔（くさび）形 3D 微細流路（マイクロチャネル）内を流れる流体・粒子の挙動を流体解析や検証実験から明らかにする。また，そのふるまいを利用して，エクソソームをサイズ別に濃縮・回収できる技術を開発する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，楔形3Dマイクロチャネルを利用してナノメートルサイズのエクソソームをサイズ別に分離・濃縮する技術を開発することを目的としている．本年度は，エクソソームをサイズ別に分ける前の基礎検討として，楔形3Dマイクロチャネルの作製法を開発し，このマイクロチャネルを用いた蛍光粒子のサイズ分離を行った．当初の予定では，マイクロ流路を流れる粒子挙動の数値流体解析を行い，最適化した条件で流路を設計・作製する予定であったが，3Dマイクロチャネルの作製法が思いのほか早く確立できたため，いくつか形状の異なるマイクロチャネルを作製し，粒子分離に利用できるかを実験的に評価した．
実験では，まず光造形式3Dプリンターで作製した構造体を用いたポリジメチルシロキサン（PDMS）製3Dマイクロチャネルの作製法を開発した．この手法は，転写用構造体の材料として市販の3Dプリント樹脂をそのまま使用でき，3Dプリント後の鋳型の追露光や追加熱処理を必要としないことから，操作工程が少なく容易にマイクロチャネルを作製できる．この方法を用いて，直線型およびスパイラル型の楔形3Dマイクロチャネルを作製し，粒子分離を検討した．その結果，1) 直線型マイクロチャネルは，下流方向に進むにつれてチャネル深さが浅くなる傾斜構造を有しており，大きさの異なる粒子（粒子径：10-90 um）をサイズ別に流路内に捕捉できる，2) スパイラル型マイクロチャネルは，チャネルの内側から外側にかけてチャネルが深くなる傾斜構造を有しており，流量や傾斜角度を変化させることで流れる粒子（粒子径：6-20 um）を分離・回収できることが明らかとなった．
本研究で得られた成果は，楔形3Dマイクロチャネルが粒子分離に利用できることを示唆しており，今後はマイクロチャネルをダウンスケール化して，ナノサイズの粒子分離を検討していく．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
流路の楔形3Dマイクロチャネルを利用してエクソソームをサイズ別に分離・濃縮するためには，まず楔形3Dマイクロチャネルが粒子分離に利用できることを実証する必要がある．本年度は，1) マイクロチャネルを流れる粒子の数値流体解析によるチャネル構造の解析，2) 楔形3Dマイクロチャネルの作製，3) 楔形3Dマイクロチャネルによる粒子分離の実施を予定していた．実験を開始してすぐに，3Dプリンターを用いるマイクロチャネルの作製技術を確立できたため，数値流体解析によるアプローチではなく，チャネルを作製して実験的に粒子流れを評価する方法に切り替えた．
直線型マイクロチャネルは，チャネル内に粒子を捕捉できることが分かった．粒径の異なる粒子（粒径 10, 45, および 90 um）を送液したところ，10 um の粒子は素通りし，他の粒子はそれぞれ異なる位置に捕捉された．粒子がトラップされる位置は，粒径とチャネルの深さに関係していたことから，捕捉したい粒子サイズに合わせて流路を設計することにより，様々なサイズの粒子をトラップできる可能性がある．また，スパイラル型マイクロチャネルを用いる実験では，楔形構造の有無によって粒子の挙動が大きく異なることが明らかとなった．さらに，チャネルのループ数，溶液の流量，粒子サイズなどを変えて実験を行ったところ，粒子サイズ（6～20 um）や流量（1-4 mL/min）を制御することで，楔形 3D スパイラルチャネルを用いて様々な粒径の粒子を分離・回収できることが分かった．
令和４年度は，従来のフォトリソグラフィー技術では作製が困難な楔形 3D マイクロチャネルの作製法を確立し，楔形 3D マイクロチャネルが粒子分離に利用できることを明らかにした．これらの成果から，研究はおおむね順調に進展していると考えられる．
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の目的は，楔形3Dマイクロチャネルを利用してナノメートルサイズのエクソソームをサイズ別に分離・濃縮する技術を開発することである．これまでに，楔形 3D マイクロチャネルによる粒子の捕捉・分離・回収が可能であることを，マイクロメートルサイズの粒子を用いて明らかにしているが，対象とするエクソソームのサイズは 50-150 nm と極めて小さい．そこでまず，現状のチャネル構造で，どのくらい小さな粒子を捕捉・分離・回収することができるかを評価する．もし思うような結果が得られない場合は，流路構造のダウンスケール化やPDMS表面の改質により克服する．当研究室で所有している 3D プリンターの分解能が足りず，ダウンサイズ化した流路の転写用構造体の作製が難しい場合は，微細加工を得意とする企業との連携や，3Dプリント構造体を外注することで研究を進めていく．この検討を進め，数十～数百 nm サイズの粒子を分離できるマイクロチャネルを開発する．粒子をどのくらいのサイズで分離できるかについて，蛍光ナノ粒子を用いた検討により評価する．また，分離した粒子を回収し，粒径分布を計測することにより，粒子の回収率や濃縮効率を評価する．その後，標準品のエクソソームを用いて，エクソソームの分離検討を行い，本技術によりエクソソームが分離できることを明らかにする．エクソソームが蛍光粒子よりも柔らかいため，蛍光粒子を用いる実験と同様の結果が得られない可能性がある．その場合，エクソソームが負に帯電していることを利用し，流路界面をデザインすることで，分離効率の向上を図る．
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