| Project/Area Number |
22K14783
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 37010:Bio-related chemistry
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
加藤 俊介 大阪大学, 大学院工学研究科, 助教 (60909125)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | 人工金属酵素 / 進化分子工学 / 指向性進化法 / C-H結合官能基化 / 金属ポルフィリノイド / ヘムタンパク質 / 生体触媒 / ポルフィリノイド |
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| Outline of Research at the Start |
本研究は、合成金属錯体を補因子とする人工金属酵素の改変へ指向性進化法を適用し、優れた触媒特性を発揮する新規生体触媒を開発することを目的とする。具体的には、非天然ポルフィリノイドを補因子としてヘムタンパク質へと導入した人工金属酵素を構築する。そして、得られた人工金属酵素のタンパク質反応場を指向性進化法により最適化することで、酵素本来の反応性を拡張する。現時点までに、非天然ポルフィリノイドの合成や、タンパク質の発現系の確立は既に完了している。補助事業期間内において今後、指向性進化法による活性中心のタンパク質反応場の最適化を行い、通常の小分子金属錯体では達成困難な高難度な物質変換の実現をめざす。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、進化分子工学的手法を遷移金属錯体へと応用し、優れた触媒特性を発揮する新規高機能触媒を開発することを目的とする。具体的には、非天然の合成ポルフィリノイドを補因子としてヘムタンパク質に再構成した「人工金属酵素」を構築し、指向性進化法（directed evolution）を駆使した遺伝子工学的な改変を実施する。2023年度は、鉄コロール錯体を補因子としてミオグロビンに導入した人工金属酵素を構築し、指向性進化法によるタンパク質反応場の改変を実施した。ミオグロビンのヘム結合サイトを構成する複数のアミノ酸残基を選定し、部位飽和変異導入（site-saturation mutagenesis）によりランダム化した変異体ライブラリをスクリーニングすることで、ABTSの酸化反応に対して高いペルオキシダーゼ活性を示す変異体を獲得することに成功した。この得られた変異体は、
改変前の人工金属酵素と比較して、24倍高い反応初速度を示すことが判明した。加えて、鉄ポルフィリン錯体を補因子としてミオグロビンに導入した人工金属酵素についても、遺伝子工学的改変を実施し、アルドキシムの脱水反応に対する触媒活性を向上させることに成功している。また、効率的な人工金属酵素の指向性進化を実現するために、Strep-tag IIを精製タグに用いた新たなハイスループットスクリーニング（HTS）手法の確立にも成功している（S. Kato et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2023, 62, e20230376.）。本HTS手法は、安価なキチン粉末をクロマトグラフィー担体として用いて、人工金属酵素の指向性進化を細胞夾雑物非存在下で実現する強力な手法である今後、このHTS手法を最大限に活用し、進化分子工学による高機能金属酵素の開発に着手する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、指向性進化法（directed evolution）による人工金属酵素の遺伝子工学的な改変を実施し、優れた触媒活性を発揮する新規高機能触媒を開発することを目的とする。2023年度は、目標の一つであった非天然金属ポルフィリノイド（鉄ポルフィセン錯体）を補因子とする人工金属酵素について、指向性進化法による改変を実施し、ニトリル合成反応における触媒活性を向上させることに成功した。また、コバルトコリン錯体・コバルトポルフィセン錯体を補因子とする他の人工酵素の構築も実施しており、今後、これら人工金属酵素の指向性進化法による改変も行う予定である。加えて、効率的な指向性進化の実現に資する基盤技術の開発にも精力的に研究を実施した。なかでも、Strep-tag IIを精製タグに用いた新規ハイスループットスクリーニング（HTS）手法は、今後の研究展開を加速する基盤技術となることが期待される。以上の成果から、おおむね順調に進展しているとの評価を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究推進方策として、以下の2項目について特に重点を置き研究を遂行する。(i) 指向性進化の結果得られた上記の鉄コロール錯体および鉄ポルフィセン錯体を含む人工金属酵素について、詳細な解析（X線結晶構造解析・速度論解析）を実施する。そして、指向性進化法により導入されたアミノ酸残基への変異が、非天然の金属錯体の触媒活性にどのように寄与しているのかを明らかにする。(ii) 2023年度に新しく構築したコバルトコリン錯体・コバルトポルフィセン錯体を補因子とする人工金属酵素について、指向性進化法による改変を実施し、優れた触媒特性を示す変異体を獲得する。この時、指向性進化法のスクリーニングには、上記のStre-tag IIを精製タグに用いた新規ハイスループットスクリーニング（HTS）手法を活用する。
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