| Project/Area Number |
22K14826
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (2023)
The University of Tokyo (2022) |
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Principal Investigator |
武田 康太 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域, 主任研究員 (20781123)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
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| Keywords | 酸化還元タンパク質 / 酵素電極反応 / 直接電子移動 / ピロロキノリンキノン / ヘム / プロトン共役電子移動 / 自己組織化膜 / 酸化還元酵素 |
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| Outline of Research at the Start |
酵素電極反応とは酵素反応と電気化学反応が共役した反応のことで、なかでもタンパク質-電極間で直接電子移動(DET)が起こる場合はDET型酵素電極反応と呼ぶ。現状、DET可能な酵素種は限られているものの、近年、研究代表者は優れたDET能を有するキノコ由来の酸化還元酵素を報告した。本課題ではピロロキノリンキノン、フラビン、ヘム等を活性中心に有する糸状菌由来の酸化還元タンパク質を対象に、DET型酵素電極反応における構造機能相関を明らかとし、より普遍的なDETの確立方法、酵素電極の出力向上における方法論を確立する。それにより糸状菌の生物機能を利用したバイオエレクトロニクス技術への展開を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
酵素による触媒反応と電極での電気化学反応を共役させた反応を酵素電極反応といい、バイオセンサーやバイオ燃料電池、物質生産へと応用できる。酵素と電極間で直接的な電子の授受が起こる直接電子移動(DET)反応は、非常にシンプルな反応系となるのが利点である。DETができるかどうかは酵素の立体構造に大きく依存しており、酸化還元酵素全体のごく一部に限られているのが課題となっている。本研究では、優れたDET反応を示す糸状菌由来のピロロキノリンキノン(PQQ)、フラビン(FAD)、ヘムなどを活性中心に有する酸化還元酵素に注目し、これらの酸化還元タンパク質の性質を明らかとし、それを利用した直接電子移動反応系の設計手法と酵素電極の開発を目的としている。
2023年度は、担子菌由来ピラノース脱水素酵素(CcPDH)のDETとドメイン間電子移動反応に関する成果が得られた。本酵素はPQQドメイン(触媒部位)とシトクロムドメイン(電子伝達部位)を有するタンパク質で、両ドメインとも電極への直接電子移動が可能である。電極上にアルキル鎖長の異なる自己組織化単分子膜を修飾することで酵素と電極間の距離を制御した。その結果、活性中心のPQQと電極間の距離が約0.15 nmを超えると、PQQドメインからのDETは起こらなくなり、シトクロムドメインを介したDET反応のみが進行することを見出した。ストップトフロー法を用いて、CcPDHの触媒反応の前定常状態を解析した。PQQの還元速度よりヘムの還元速度が遅く、ドメイン間電子移動が律速であること明らかとなった。さらに、糸状菌由来のシトクロムドメインは、異種であるバクテリア由来グルコース脱水素酵素の電子受容体となることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DET型酵素電極は、酸化還元酵素と電極基板のみで構成される非常にシンプルな系であることから電気化学デバイスへの応用が期待される。これまでにDETが報告されている酵素は数十種類程度と限られており、触媒部位に加えて分子内メディエーターとして働く電子伝達部位(酸化還元中心にヘム、タイプI銅、鉄硫黄クラスター等を有する)をもつマルチドメイン酵素がほとんどである。
2023年度は、シトクロムドメインを有するピラノース脱水素酵素の電子移動反応を解析し、酵素-電極間の距離に応じて電子伝達経路が変化することを見出した。この反応系を利用して、ドメイン間電子移動を介したDET型酵素電極反応を評価することができるようになった。本成果は、糸状菌シトクロムの構造的・機能的特性、ならびに酵素のターンオーバーにより達成される触媒電流に寄与するドメイン間電子移動(触媒中心からヘム)とDET(ヘムから電極)について新たな知見を与えるものであり、シトクロム融合酵素のタンパク質設計戦略にも役立つものである。また、外的要因(化合物、pH、温度、溶媒など)によってドメイン間電子移動を阻害したり促進したりすることで、ドメイン間電子移動の反応性に基づくような新規なタイプのバイオセンサーを開発が期待できる。
ストップトフロー法から、前定常状態での糸状菌由来のピラノース脱水素酵素のドメイン間電子移動反応を解析し、定常状態におけるpH依存的な反応速度の変化は、本研究で先に明らかとした酵素内のPQQとヘムの酸化還元電位差に起因することが示唆された。
切り離したシトクロムドメインが異種由来の脱水素酵素のメディエーターとして働くすることがわかった。これは来年度のシトクロムドメインをプラットフォームとするDET型酵素電極の開発につながる成果である。以上より、本年度の研究計画目標をほぼ達成できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度までにピラノース脱水素酵素の触媒ドメインのDET法による解析手法を確立できたので、PQQの酸化還元状態、配位する金属種の効果などを調べ、触媒反応機構の知見を得る。
DETを可能にするタンパク質改変技術の開発を目指し、シトクロムドメインの有用性について詳細に研究する。ピラノース脱水素酵素の全長酵素を用いた酵素電極で、シトクロムドメインの有無に関して、電極の3次元的構造や、電極表面への酵素の吸着配向との関係、至適pHについて調べる。
組換え発現系によって調製した糸状菌由来シトクロムドメイン単体が、DETが困難な酵素の一つであるバクテリア由来のPQQ依存性グルコース酵素の電子受容体となり得たことから、シトクロムドメインとの複合的な状態での電極固定化を検討し、DET型酵素電極の開発を行う。
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