古細菌が持つ独特なヌクレオチド除去修復機構の解明

Research Project

Project/Area Number	22K14832
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	白石都九州大学, 薬学研究院, 助教 (00813940)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000) Fiscal Year 2025: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	古細菌 / アーキア / ヌクレオチド除去修復 / DNA修復
Outline of Research at the Start	真正細菌と真核生物に属さず独立した生物群を構成する古細菌は生命の起源に近い始原的な性質を持つ。原始的な地球で誕生し、高紫外線量下で生存してきた古細菌群は損傷に対する何らかの強力な対応機構を有していると考えられる。真正細菌および真核生物は、紫外線で生じるDNA損傷を修復するヌクレオチド除去修復（NER）機構を有しているが、古細菌はNER機構が長らく不明のままである。本研究では、生化学的・細胞生物学的手法により古細菌が持つNER機構を明らかにし、古細菌群の高い環境適応性を支える分子基盤を理解するとともに、核酸関連因子の新規機能の発掘、さらに核酸化学およびゲノム工学分野の進展に繋げる。
Outline of Annual Research Achievements	本研究は超好熱性古細菌が持つ紫外線損傷修復機構を明らかにすることを目的として進めている。紫外線損傷DNAに特異的に結合するタンパク質の網羅的同定を行った。ビオチン化した(6-4)光産物を含む損傷型と非損傷型の二本鎖DNAを用意し、超好熱性古細菌Thermococcus kodakarensis細胞抽出液からこれに結合するタンパク質を精製した。LC-MS/MS解析により、核酸結合性因子とその関連因子と考えられるタンパク質や機能未知タンパク質を多数同定した。その中から損傷塩基を含むDNAを使用した特に高いスペクトルカウント数を示したタンパク質とその関連因子を抽出した。現在、これら候補タンパク質の配列情報や既知の機能を基に、順次遺伝子クローニングを進めている。一部のタンパク質については大腸菌発現系を用いて組換えタンパク質として高純度に精製できた。生化学的解析から既知の酵素活性を保持していることが分かったので、これから損傷塩基あるいはそれを模倣したDNA基質に対する酵素活性を調べる予定である。損傷塩基を含むDNAを用いたスクリーニングと並行して、真核生物型ヌクレオチド除去修復関連因子XPBの古細菌型オルソログの機能解析も進めている。T. kodakarensis抽出液に存在するXPB相互作用タンパク質を、抗XPB抗体と組換えXPBを用いて回収した試料をLC-MS/MS解析した結果から、T. kodakarensis XPBに結合する可能性のあるタンパク質を同定することができた。現在、XPBと推定相互作用候補タンパク質との直接結合が検出できるかどうかを調べるため、酵母ツーハイブリッド法を用いた解析を進めている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 紫外線損傷DNAに特異的に結合するタンパク質のスクリーニングは順調に進行し、興味深い因子が多数ヒットしてきている。生化学的機能解析に進めるために、一部の候補因子については問題なく組換えタンパク質として高純度に精製でき、既知の酵素活性を保持していることを分析できた。ただ現時点では損傷特異性を持つかどうかのin vitroでの機能解析までは進められていない。XPB相互作用タンパク質の解析については、スクリーニング結果から興味深い因子を多数同定できており、酵母ツーハイブリッド法を用いたXPBとの相互作用解析を開始している。以上、本研究の目的達成に向けて着実に研究を進めている。
Strategy for Future Research Activity	紫外線損傷DNAに特異的に結合するタンパク質を同定しているが、まだ一部の候補タンパク質を組換えタンパク質として精製できていないものがあるため、それを進める。精製タンパク質として調製できている候補因子については、真核生物型ヌクレオチド除去修復機構が修復対象とするDNA基質を用いて、各精製タンパク質の基質結合能、損傷認識や酵素活性を調べる。必要であれば、より厳しい条件でスクリーニングを再度行い、損傷を認識するタンパク質の同定を試みる。真核生物型ヌクレオチド除去修復関連因子XPBの古細菌型オルソログの機能解析に関しては、現在進行中の酵母ツーハイブリッド法を用いたXPBと推定XPB相互作用タンパク質の相互作用解析を進める。陽性クローンは組換えタンパク質として調製し、in vitroでの相互作用解析を行う。