Development of novel psoralen conjugated triplex forming oligonucleotides and its application to a photo genome editing technology
Project/Area Number |
22K14839
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Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Review Section |
Basic Section 38040:Bioorganic chemistry-related
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Research Institution | Nagasaki University |
Principal Investigator |
三瓶 悠 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 助教 (70908540)
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Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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Keywords | 1-位ソラレン導入型三重鎖形成核酸 / 三重鎖構造安定化 / 標的配列の拡張 / 二架橋体形成 / 三重鎖形成核酸 / 光応答性機能性核酸 / ソラレン / ゲノム編集 / DNA二重鎖切断 |
Outline of Research at the Start |
本研究では独自の設計理論に基づいた新規光応答性機能性核酸を開発し、生体内のDNA修復機構を利用した光ゲノム編集技術への応用を目指す。DNA架橋性分子であるソラレンを、任意のDNA二重鎖と三重鎖を形成する三重鎖形成核酸(TFO)に導入し、DNA二重鎖の任意の部分での架橋体形成を狙う。この架橋部位は生体内の種々のDNA修復因子によって異物として認識され、ソラレンの結合部位で二重鎖切断(DSBs)が誘導される。この性質を利用し、標的DNA配列の除去を目的としたゲノム編集ツールとしての応用を検討する。
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Outline of Annual Research Achievements |
デオキシリボース1-位ソラレン導入型三重鎖形成核酸(Ps-TFO)の機能評価を目的とし、下記の三項目について実施した。 1. 1-位ソラレン導入型デオキシリボースのアミダイト合成と核酸配列への導入:市販で入手可能なデオキシリボース誘導体を出発原料とし、10工程の合成反応を用いた構造変換により、1-位ソラレン導入型デオキシリボースのアミダイト化合物の合成に成功した。合成したアミダイトはホスホロアミダイト法によって核酸配列中へと導入し、目的とするPs-TFOの合成を達成した。 2. 合成したPs-TFOの三重鎖形成能評価:合成したリンカー長の異なる二種のアミダイトをそれぞれ導入したPs-TFOの三重鎖形成能評価をTm解析システムを用いて実施した。標的二重鎖のうち、片側一本鎖にプリン塩基を多く含有する配列でないと安定した三重鎖構造形成は不可能である。つまりこのプリン豊富な一本鎖中に含まれるピリミジン塩基部位(ミスマッチ部位)は三重鎖構造の不安定化を招く原因となる。一方、今回合成したPs-TFOのソラレン導入部位を、このミスマッチ部位に相当する位置に配置し、三重鎖を形成させた場合、ピリミジン塩基との相互作用と考えられるソラレンのインターカレーションにより、ソラレン非導入型のTFOよりも形成される三重鎖構造が優位に安定化されていることが分かった。この結果は、今回合成したPs-TFOにより、三重鎖の標的配列が拡張できる可能性を示唆するものである。 3. 合成したPs-TFOの架橋体形成能評価:合成したPs-TFOの標的二重鎖に対する架橋能を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により評価した。その結果、ピリミジン塩基(チミン、シトシン)と効率的に二架橋体形成することが分かり、不可逆的な三重鎖構造が形成できることが分かった。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
一年度目の目標であった、デオキシリボース1位ソラレン導入型三重鎖形成核酸の合成を達成し、その機能評価を行うことができた。結果は望んでいたものであり、応用研究へ展開していけることが分かった。
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Strategy for Future Research Activity |
今後、主に下記三項目について重点的に推進する。 1.配列一般性の検討:今回合成を達成した1位ソラレン導入型三重鎖形成核酸(Ps-TFO)の標的核酸の配列一般性を検討する。 2.Ps-TFOゲノム編集効率の評価:三重鎖形成核酸はDNA二重鎖切断誘発能を有することが知られている。この性質を利用し、当研究室で構築した迅速ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を用いて、今回合成したPs-TFOのゲノム編集効率を評価する。 3.遺伝子増幅型がん細胞を標的としたPs-TFOの抗がん作用の評価:一部のがん細胞では、特定の遺伝子のコピー数が増幅されることで、がん化が促進されている。この増幅された遺伝子を標的としたTFOが複数のDNA二重鎖切断を誘起することで細胞にストレスがかかり、がん細胞選択的にアポトーシスが誘導されることが知られている。今回合成したPs-TFOは通常のTFOよりも幅広い配列を標的にできることが示されたので、本Ps-TFOの遺伝子増幅型がん細胞に対するより選択的な配列を標的とした、抗がん剤としての可能性を探る。
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Report
(1 results)
Research Products
(11 results)