ネコヘルペスウイルスの新規受容体の同定と機能解析

• Project/Area Number: 22K15003
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 米満 研三 国立感染症研究所, 安全管理研究センター, 研究員 (60902997)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: ネコヘルペスウイルス１型 / FHV-1 / 受容体 / ネコヘルペスウイルス / 宿主特異性 / モノクローナル抗体

Outline of Research at the Start

ネコヘルペスウイルス1型(FHV-1)は非常に宿主域が狭く、ネコ科動物またはネコ科由来培養細胞のみに感染することが知られている。ウイルスの宿主域を規定する因子の一つとして、ウイルスの細胞への侵入に関与する受容体が挙げられる。本研究では、作製したモノクローナル抗体を用いてFHV-1の狭い宿主域を規定していると考えられる受容体を同定し、その機能解析を行う。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、未だ明らかになっていないネコヘルペスウイルス(FHV-1)の受容体を同定し、機能解析することを目的とする。ネコ由来細胞の細胞膜表面を認識し、FHV-1の感染を阻害する抗体の作製に成功しており、本抗体が認識する分子を同定するために実験を行った。ネコcDNAを用いた発現クローニングについて、パンニング、ソーティングによる同定を試みたが分子の同定に至らなかったので、免疫沈降法とLC-MS/MSを用いた分子同定を試みた。いずれもネコ由来の細胞株であるCRFK細胞とFL74細胞について、磁気ビーズを用いたIPを実施した。ウエスタンブロッティングでは特異的なバンドを確認できたが、銀染色では確認できなかった。抗原量、抗体量、溶出条件等について条件検討したが銀染色での特異バンド検出には至らなかった。ウエスタンブロットでバンドが確認できた、CRFK細胞の約70kDa、FL74細胞の約50kDaの位置のゲルを切り出し、LC-MS/MSによるゲル内タンパク質同定を実施したところ、両方の検体で高いスコアを示した分子Xを同定した。この分子がFHV-1の受容体として機能している可能性がある。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

目的分子の同定までは至っていないが、LC-MS/MSにより可能性のある分子の同定に成功した。

Strategy for Future Research Activity

免疫沈降法とLC-MS/MSによりFHV-1の受容体の可能性がある分子Xを同定した。本分子について、ネコ細胞からの遺伝子クローニングまたは遺伝子合成によりタンパク質を発現し、抗体との反応性を確認する。定量PCRの系を作製し、各種ネコ由来細胞株、ネコ臓器について遺伝子発現量の定量を行う。感受性細胞からのノックアウトによる感染性の検討を行う。以上の実験により、受容体としての機能を確認する予定である。