Project/Area Number |
22K15042
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Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Review Section |
Basic Section 43010:Molecular biology-related
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Research Institution | Kyoto Sangyo University |
Principal Investigator |
石橋 幸大 京都産業大学, 生命科学部, 研究員 (30880968)
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Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
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Keywords | ゼブラフィッシュ / 初期発生 / RNA / 酸化ストレス / 胚発生 |
Outline of Research at the Start |
活性酸素によるRNAの酸化損傷は、転写から翻訳までの遺伝子発現制御を介して、正常な生体機能の実現に密接に関与することが示唆されている。一方で、多細胞生物における酸化損傷RNAの動態、すなわちいつ・どのようなRNAに酸化損傷が生じて、それが個体形成の実現にどのように貢献するかは未知である。本研究では、ゼブラフィッシュの初期発生をモデルに、酸化損傷が生じるRNAを発生段階ごとに網羅的に同定する。また、それらRNAの翻訳や遺伝子発現制御を含めた細胞の応答を評価する。これにより、酸化損傷RNAの動態が介入する発生メカニズムを時空間的に明らかにし、細胞・生体の恒常性を担保するしくみに迫る。
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Outline of Annual Research Achievements |
ゼブラフィッシュの初期発生過程において、活性酸素の一種である過酸化水素の細胞ないレベルと分布は発生段階や細胞群ごとにダイナミックに変化しており、これによって生じるRNAの酸化とトランスクリプトームの変化が密接にリンクしていると考えられる。まずは酸化損傷の生じたRNAを網羅的に同定するために、ゼブラフィッシュ胚からRNAを抽出したのち抗8-oxoG抗体を用いたRNA免疫沈降によって酸化損傷RNAを精製した。ポジティブコントロールとして、過酸化水素処理をしたゼブラフィッシュ胚からもRNAを抽出し同様の精製をおこなった。次世代シークエンスに供する前にRNAのクオリティコントロールをノザンブロッティングやRT-qPCRで行なったところ、酸化損傷に非特異的なRNAも大量に精製されていることが判明した。後の検討で、抽出したトータルRNAをそのまま免疫沈降に用いたことによるリボソームRNAのコンタミが問題であり、リボソームRNAの除去とRNAの断片化ののちに免疫沈降による精製をおこなう必要があると判明した。現在は改良したプロトコルによるRNAの精製と次世代シークエンスのライブラリ調整をおこなっている。 次世代シークエンスが遅れており内在のmRNAを用いた評価はおこなえていないが、蛍光タンパク質をコードするレポーターmRNAに酸化損傷を施し、ゼブラフィッシュ胚へのインジェクション実験をおこなった。その結果、翻訳開始因子eIF2alphaのリン酸化に端を発する統合ストレス応答や、MAPキナーゼp38のリン酸化によるストレス応答が惹起されることがわかった。各々のタンパク質のリン酸化の程度は、mRNAの酸化損傷の程度に応じて大きくなることも見出した。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ライブラリ調整のための酸化損傷RNAの精製法の検討に時間を要してしまったため、次世代シークエンスによる酸化損傷RNAの網羅的同定については遅れが生じている。これに伴い、ゼブラフィッシュ胚の内在mRNAのうち酸化損傷が生じている転写産物を用いた評価まで至っていない。一方で内在mRNAではないながらも、蛍光タンパク質レポーターmRNAへの酸化損傷導入とインジェクション実験によって、ストレス応答の評価は進んでいる。
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Strategy for Future Research Activity |
免疫沈降による酸化損傷RNAと次世代シークエンスによる、ゼブラフィッシュ初期発生過程におけるRNAの酸化損傷の網羅的同定を早急に進める。これで得られた内在の酸化損傷のターゲットの情報をもとに、レポーターmRNA同様に酸化損傷の導入とインジェクション実験をおこないストレス応答や発生への影響を評価していく。 酸化損傷によって生じる塩基である8-oxoG上では、コドンの解読異常によるリボソームの翻訳伸長が停止することが知られている。リボソームの翻訳伸長が長時間にわたって停止すると、後続リボソームが衝突し二量体リボソームの形成が誘発される。本来、この二量体リボソームは品質管理機構で解消されるとともに、この解消機構と共役してしばしば異常なmRNAの分解も誘導される。mRNAに生じた酸化損傷が、これらの品質管理機構の標的となっているかを評価するため、品質管理機構の引き金となる因子を欠損するゼブラフィッシュの変異体を用いた解析をおこなう。
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