がん遺伝子産物RasのGTP加水分解に伴うアロステリック構造変化の解明

• Project/Area Number: 22K15048
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 槇野 義輝 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 特命助教 (80822337)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: NMR / Ras蛋白質 / 構造生命科学 / 創薬科学 / Ｘ線結晶構造解析 / SACLA/SPring-8

Outline of Research at the Start

本研究では、核磁気共鳴（NMR）分光法およびX線結晶構造解析を駆使し、がん遺伝子産物RasのアロステリックなGTP加水分解機構の詳細を原子分解能レベルで解明することを目的として研究を遂行する。Rasはヒトのがん全体のおよそ30％において常時活性化しており、有望な創薬ターゲットの1つである。本研究では、光制御可能なCage化合物並びにフォトクロミック分子を利用した光応答性Rasを用いて、NMR、SACLA、SPring-8を駆使し、活性型RasのGTP加水分解反応機構におけるアロステリックな構造変化と活性制御メカニズムを時分割・原子分解能レベルで解明し、新たな創薬基盤技術の構築に寄与する。

Outline of Annual Research Achievements

低分子量G蛋白質RASは、細胞内においてGTP(活性型)/GDP(不活性型)結合サイクルを介して、標的分子との結合/解離が調節し、細胞の増殖等の細胞内シグナル伝達を制御している。本研究では、GTP加水分解反応、すなわち不活化機構に着目し、光制御可能なcagedGTPを用い、その構造パスウェイをNMRによる速度論解析、X線結晶構造解析等により解明することを目的として研究を実施した。併せて、GTP分解酵素活性化蛋白質であるGAP存在下/非存在下でのGTP加水分解速度についてcagedGTP・RASを用いた溶液NMRによる速度論解析を実施し、その不活化機構の解明を試みた。
2022年度は、cagedGTP/RASを用いた時分割X線結晶構造解析、及び光照射後のNMRスペクトルの経時変化のトレースによる応速度論解析を実施し、GTP加水分解反応に係る構造変化はGTP結合領域のみならず隣接領域でも生じており、その速度論はState2と呼ばれるGTP結合領域の閉じた状態の時間占有率が極めて小さいことを示唆する結果を得た。
2023年度は、これまでに得られたデータを詳細に解析するとともに、微結晶試料を用いた固体NMRによる速度論データを解析し、構造及び速度論的にState2の時間占有率が極めて小さい、若しくは見かけ上State2を経ないで不活化が進行する系の存在を示唆するデータを得た。この結果は当該年度に実施した、RAS変異体、並びにGAP存在下/非存在下でのNMRによる速度論解析のデータによっても示唆され、RASの不活化メカニズムの解明の一端を解明するに至った。
さらなる不活化メカニズムの解明については、フォトクロミックRASを用いた活性構造の人工的な制御が必要であると考えるが、当該年度においてはその極大吸収波長の測定等に留まっており、今後は光照射下での各種分光測定法の確立等が課題である。

Research Products

• [Presentation] GTP加水分解酵素GAPによるRASのState認識機構 (2023)
  • Author(s): 匂坂和歌子, 槇野義輝, 堀川太介, 吉川陽子, 河村高志, 南後恵理子, 熊坂崇, 島扶美
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会 （2023年12月6日）
• [Presentation] 光反応性GTPを用いたRASの不活化機構の解明 (2023)
  • Author(s): 堀川太介, 槇野義輝, 匂坂和歌子, 吉川陽子, 河村高志, 南後恵理子, 熊坂崇, 島扶美
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会 （2023年10月31日）
• [Presentation] SACLA/SPring-8/NMRを駆使した低分子量G蛋白質Rasの不活性化機構におけるアロステリック構造変化の解明 (2022)
  • Author(s): 槇野義輝, 河村高志, 吉川陽子, 南後恵理子, 熊坂崇, 島扶美
  • Organizer: 第95回生化学会大会
• [Presentation] 河村高志, 槇野義輝, 長谷川和也, 吉川陽子, 島扶美, 熊坂崇 (2022)
  • Author(s): 低分子量Gタンパク質H-Rasのフリーズトラップ結晶構造解析によるGTPase活性分子メカニズムの追跡
  • Organizer: 第95回生化学会大会