| Project/Area Number |
22K15055
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
八代 悠歌 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 特任助教 (40836483)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | microRNA / プロセシング / Drosha/DGCR8 / RNA修飾酵素 / 構造 |
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| Outline of Research at the Start |
近年のエピトランスクリプトーム解析技術の発展により、RNA修飾が遺伝子の発現調節においてもはたらくことが明らかにされてきた。最近の研究により、tRNAの修飾酵素であるMETTL1とTRUB1が、let-7ファミリーのmiRNAの発現を制御することが発見された。しかし、METTL1およびTURB1がlet-7 miRNA前駆体の核内プロセシングを促進する際の分子メカニズムは未解明である。本申請課題では、X線結晶構造解析、生化学・細胞生物学的解析を駆使し、METTL1およびTRUB1が、let-7 miRNA前駆体の核内プロセシングを促進する際の特異的な基質認識と作用機構の分子基盤の解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、X線結晶構造解析、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析、生化学・細胞生物学的解析の手法をもちいて、RNA修飾酵素によりmiRNA前駆体のプロセシングが促進される際の基質認識と作用機構の分子基盤の解明に取り組む。前年度に引き続き、tRNAのシュードウリジル化酵素であるTruB1がlet-7 miRNA前駆体の核内プロセシングを促進する現象に着目し、そのメカニズムの解析に取り組んだ。２年次は、前年度に引き続き、生化学的手法を用いて、let-7 miRNA前駆体とTruB1タンパク質の相互作用解析、TruB1とDrosha/DGCR8のタンパク質間相互作用の解析をおこなった。また、異なるコンストラクトのDrosha/DGCR8リコンビナントタンパク質について、試験管内プロセシング反応をおこない、TruB1リコンビナントタンパク質の添加がプロセシング反応にもたらす効果を調べた。しかしながらリコンビナントタンパク質をもちいた試験管内反応の系では、培養細胞をもちいた先行研究により報告された、let-7 miRNAのプロセシング反応の促進やTruB1によるRNA認識を観察することができず、構造解析の手法により分子基盤を明らかにすることを目指した当初の研究計画において進捗を十分に得ることができなかった。そこで、miRNAのプロセシングに関与することが報告されている、いくつかのRNA修飾酵素についても新たに研究対象として加えた。これらのRNA修飾酵素についても、リコンビナントタンパク質の発現・精製系の確立と反応活性の評価、および基質RNAとの相互作用の解析に取り組んだ。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初想定していた研究計画を順調に進めることができなかったため、研究計画を変更し、あらたに複数のRNA修飾酵素を研究の対象として加えた。変更した研究計画においては、生化学的解析や構造解析のための試料の準備を進め、進捗を得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、現在解析をおこなっているRNA修飾酵素について、引き続き反応活性の評価、およびRNAとの相互作用の解析を進める。RNAおよびタンパク質の変異体を作製し、導入した変異の反応活性およびRNAとの相互作用への影響を解析することで、基質認識のメカニズムを調べる。さらに、RNA修飾酵素と標的RNAとの複合体精製をおこない、クライオ電子顕微鏡による単粒子構造解析をおこなうことで、RNA修飾酵素の作用における分子基盤の詳細を解析する。
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