| Project/Area Number |
22K15061
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
宮崎 亮次 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30827564)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | 新生ポリペプチド鎖 / in vivo光架橋法 / VemP / Secトランスロコン / PpiD / YfgM / DsbA / AlphaFold 2 / 大腸菌 |
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| Outline of Research at the Start |
タンパク質は、リボソームに合成される途上の新生ポリペプチド鎖の状態で様々な因子と相互作用することで、適切な場所に運ばれ、成熟していく。新生鎖が重要な細胞機能制御に関わることも示され、細胞内での新生鎖の迅速な相互作用動態の理解はさらに重要となっている。
本申請研究は、タンパク質膜透過装置SecY/E/Gを膜透過途上の状態が安定なVemPをモデル新生鎖とし、in vivo光架橋法を用いて膜透過途上のVemP新生鎖とSecY/E/G関連因子との相互作用動態変化を解析する。それにより、VemPのような膜透過途上の新生ポリペプチド鎖の迅速な相互作用の動態変化を細胞内で、かつ、分子レベルで解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内のタンパク質は、適切な場所に配置され、機能的構造に折り畳まれることで機能する。この成熟過程は、翻訳後にリボソームから離れた後のみならず、翻訳途上のリボソームと結合した新生ポリペプチド鎖の状態でも進行する。近年、新生鎖の構造状態や相互作用を理解することはさらに重要になりつつあるが、生細胞内で迅速に起こる新生鎖の動態変化を解析した研究は少ない。特に、タンパク質膜透過装置Secトランスロコンなどにより生体膜を透過途上の新生鎖に関しての研究はさらに限られている。
本研究では、膜透過途上の新生鎖状態が安定なVemPをモデル基質とし、in vivo光架橋法によってVemPとSecトランスロコンやPpiD等の関連因子との細胞内での相互作用様式やその迅速な動態変化を解析し、新生ポリペプチド鎖の膜透過機構を解明することを目的とする。
前年度は、VemP新生鎖と相互作用する機能未知の膜タンパク質PpiDに着目して、その役割を調べた。PpiDの全領域を対象としたin vivo光架橋解析により、PpiDがパートナー因子であるYfgMやSecYEGトランスロコンだけでなく、膜透過駆動モータータンパク質SecDFやジスルフィド結合導入酵素DsbAとも相互作用することを見出し、AlphaFold 2による構造予測等も利用して細胞内でそれらの因子からなる巨大なSec複合体構造を取りうることを示した。
当該年度は、PpiDとDsbAの機能連携の可能性を検証し、ある基質タンパク質においては、PpiDがDsbAによる適切なジスルフィド結合導入を助けることを見出した。さらに、巨大なSec複合体構造を対象に詳細な架橋解析を行い、それらの新生鎖基質結合に重要な領域を同定し、SecYEGとSecDFの相互作用様式も解明しつつある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
タンパク質の多くは、翻訳途上時のリボソームと結合した新生鎖の状態で様々な因子と相互作用し、それにより成熟していく。そのため、タンパク質の成熟過程を理解するには、細胞内での新生鎖の迅速な相互作用動態を理解することが重要である。
本研究は、細胞内で翻訳が安定に停止するVemPをモデル基質とし、in vivo光架橋法を用いてVemP新生鎖の相互作用因子の同定とそのダイナミックな相互作用動態の解析を行い、それを通じて、細胞内で新生ポペプチド鎖の迅速な相互作用動態を解析できることを実証するものである。
前年度に、VemP新生鎖と相互作用する機能未知の膜タンパク質PpiDに着目した解析を行い、PpiDがパートナー因子であるYfgMやSecYEGトランスロコンだけでなく、膜透過駆動モータータンパク質SecDFやジスルフィド結合導入酵素DsbA等と同時に相互作用して巨大な複合体を細胞内で形成することを見出した。
当該年度は、PpiDを中心としたこの巨大なSec複合体に着目して解析を進めた。その結果、PpiDとDsbAの両方が適切なジスルフィド結合導入に重要となる基質タンパク質を同定し、PpiDとDsbAが機能連携することを見出した。また、巨大なSec複合体に着目した架橋解析を行い、SecYとSecDの相互作用を捉えることに成功し、新生鎖基質相互作用部位も同定しつつある。
以上のように、本年度はおおむね順調に研究が進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当該年度の研究では、VemP新生鎖と相互作用するPpiDを中心としたSec巨大複合体に焦点をあてて研究を進め、その構成因子であるPpiDとDsbAの機能連携を明らかにし、Sec巨大複合体の構成因子間の相互作用やその新生鎖基質結合も同定しつつある。
今後はVemPをモデル基質として利用し、VemPがSec巨大複合体の構成因子（SecY/E/G、SecD/F、PpiD/YfgM、DsbA）それぞれとどのように動的に相互作用していくかを解析し、VemP等の新生鎖が膜透過する機構を詳細に解析する。また、このSec巨大複合体は実験的な構造が分かっていないため、その構造やVemP-リボソーム新生鎖複合体との構造決定を目指し、解析を進める予定である。
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