聴覚や平衡感覚に関わる機械刺激-電気信号変換の構造基盤の解明

• Project/Area Number: 22K15072
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 43040:Biophysics-related
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 草木迫 司 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (80815316)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2022: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
• Keywords: チャネル / 膜タンパク質 / クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 / 機械刺激

Outline of Research at the Start

聴覚や平衡感覚に関わる機械刺激-電気信号変換（Mechanoelectrical transduction: MET）チャネル複合体は，TMCタンパク質といくつかのサブユニットにより構成されるが，その作動機構には不明な点が多く残されている。本研究では，制御サブユニットによるチャネル活性調節機構を含めたMETチャネル複合体の作動機構の解明を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

METチャネル複合体は複数のサブユニットから構成される。TMCタンパク質（TMC1/TMC2）がイオン透過経路を形成し、膜タンパク質であるTMIEやLHFPL5、細胞内因子であるCIB2/CIB3が補助サブユニットとしてMETチャネルの活性を調節すると考えられている。しかし、METチャネル複合体を構成する各サブユニットがどのようにMETチャネル活性を調節するのか、そして機械刺激によってどのようにチャネルが開閉するのかという核心的な問いについては未だ謎に包まれている。これまでにTMCとCIBの複合体サンプルの調製に成功しており、本年度はさらにTMIEやLHFPL5などの補助サブユニットをTMC-CIBと共発現させることにより、構成因子を増やした複合体形成の条件検討をおこなった。今後さらに複合体形成条件の最適化を進める。また、TMC-CIB複合体のnanodisc再構成サンプルを用いて、開状態の構造決定を目指した。具体的には、nanodisc再構成サンプルにβ-cyclodextrinを添加することにより、nanodisc中の脂質層を薄くすることで、疑似的に膜が伸展した状態を作り出すことを試みた。β-cyclodextrin添加の結果、nanodiscの崩壊が確認されたため、今後β-cyclodextrinの濃度やインキュベート時間などの条件検討を進める。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Nanodiscに再構成されたTMC-CIB複合体の構造解析が進み、密度マップの改善がみられているため。

Strategy for Future Research Activity

TMIEやLHFPL5などを含めたMETチャネル複合体の構造決定を目指す。β-cyclodextrinのインキュベート条件の検討を含めて、開状態の構造決定を目指す。

Research Products

• [Journal Article] Cryo-EM structures of thermostabilized prestin provide mechanistic insights underlying outer hair cell electromotility (2022)
  • Author(s): Futamata Haon、Fukuda Masahiro、Umeda Rie、Yamashita Keitaro、Tomita Atsuhiro、Takahashi Satoe、Shikakura Takafumi、Hayashi Shigehiko、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Homma Kazuaki、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 13 Issue: 1 Pages: 6208-6208
  • DOI: 10.1038/s41467-022-34017-x
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structure and engineering of the minimal type VI CRISPR-Cas13bt3 (2022)
  • Author(s): Nakagawa Ryoya、Kannan Soumya、Altae-Tran Han、Takeda Satoru N.、Tomita Atsuhiro、Hirano Hisato、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Yamashita Keitaro、Zhang Feng、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • Journal Title: Molecular Cell Volume: 82 Issue: 17 Pages: 3178-3192
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.08.001
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural insights into inhibitory mechanism of human excitatory amino acid transporter EAAT2 (2022)
  • Author(s): Kato Takafumi、Kusakizako Tsukasa、Jin Chunhuan、Zhou Xinyu、Ohgaki Ryuichi、Quan LiLi、Xu Minhui、Okuda Suguru、Kobayashi Kan、Yamashita Keitaro、Nishizawa Tomohiro、Kanai Yoshikatsu、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 13 Issue: 1 Pages: 4714-4714
  • DOI: 10.1038/s41467-022-32442-6
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Endogenous ligand recognition and structural transition of a human PTH receptor (2022)
  • Author(s): Kobayashi Kazuhiro、Kawakami Kouki、Kusakizako Tsukasa、Miyauchi Hirotake、Tomita Atsuhiro、Kobayashi Kan、Shihoya Wataru、Yamashita Keitaro、Nishizawa Tomohiro、Kato Hideaki E.、Inoue Asuka、Nureki Osamu
  • Journal Title: Molecular Cell Volume: 82 Issue: 18 Pages: 3468-3483
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.07.003
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structure of the Dicer-2-R2D2 heterodimer bound to a small RNA duplex (2022)
  • Author(s): Yamaguchi Sonomi、Naganuma Masahiro、Nishizawa Tomohiro、Kusakizako Tsukasa、Tomari Yukihide、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nature Volume: 607 Issue: 7918 Pages: 393-398
  • DOI: 10.1038/s41586-022-04790-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cryo-EM structures of thylakoid-located voltage-dependent chloride channel VCCN1 (2022)
  • Author(s): Hagino Tatsuya、Kato Takafumi、Kasuya Go、Kobayashi Kan、Kusakizako Tsukasa、Hamamoto Shin、Sobajima Tomoaki、Fujiwara Yuichiro、Yamashita Keitaro、Kawasaki Hisashi、Maturana Andr?s D.、Nishizawa Tomohiro、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 13 Issue: 1 Pages: 2505-2505
  • DOI: 10.1038/s41467-022-30292-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structure of the type V-C CRISPR-Cas effector enzyme (2022)
  • Author(s): Kurihara Nina、Nakagawa Ryoya、Hirano Hisato、Okazaki Sae、Tomita Atsuhiro、Kobayashi Kan、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Yamashita Keitaro、Scott David A.、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • Journal Title: Molecular Cell Volume: 82 Issue: 10 Pages: 1865-1877
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.03.006
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Remarks] 骨代謝に関わるPTH1受容体のシグナル伝達複合体を可視化（東京大学プレスリリース）
  • URL: https://www.s.u-tokyo.ac.jp/ja/press/2022/8014/