| Project/Area Number |
22K15086
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 43050:Genome biology-related
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
秋山 光市郎 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 特任研究員 (10800675)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | バクテリアコンデンシン / 大腸菌 / 染色体分配 / rDNA / FROS / DNA結合タンパク質 / MukBEF / 染色体 / 部位特異的光架橋 / 染色体凝縮 / タンパク質間相互作用 |
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| Outline of Research at the Start |
細菌の染色体DNAは細胞自身の大きさよりもはるかに長く、高度に凝縮されて細胞内に格納されている。DNA凝縮においては、コンデンシンというタンパク質複合体が中心的な役割を担う。本研究では、大腸菌のコンデンシンであるMukBを対象とした解析を行い、DNA凝縮の分子機構を解明する。代表者らはこれまでにMukBの一本鎖DNA結合の重要性を見出しており、その成果に立脚した研究を推進することでDNA凝縮の新たな分子機構モデルを提案することを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、(A)一本鎖DNAに結合したMukBEF複合体によるDNA凝縮の検出、(B)一本鎖DNA結合後のMukBの構造状態の解析、の2つの実験を通して、一本鎖DNA領域に結合したMukBがDNAを凝縮する分子機構の解明を目指す。(A)(B)のいずれにおいても大腸菌の細胞を用いた実験と精製タンパク質を用いた生化学実験をそれぞれ実施し、in vivo とin vitroの両面からアプローチする。
(A)に関して、細胞内での一本鎖DNA領域として転写が盛んなrDNA領域を想定している。2023年度は、細胞内の異なる2つのrDNA領域を赤色蛍光タンパク質mCherry及び緑色蛍光タンパク質msfGFPで標識可能な大腸菌株を作製し、蛍光顕微鏡でmCherryとmsfGFPの起点を観察することに成功した。DNA領域の標識には、2種類のparS配列とそれらにそれぞれ結合する蛍光タンパク質融合型ParBタンパク質を利用する系 (Gaal et al., 2016, Genes Dev.) を用いた。また、この大腸菌株にmukB欠失変異を導入した菌株の作製も完了した。今後、MukBの有無でのrDNA同士の近接の程度を定量し比較する。
(B)の実験では、MukBによるDNA凝縮が「一本鎖DNA結合」→（MukBの構造変化）→「MukFとの相互作用」→「DNA凝縮」という過程を辿るという仮説を立て、一本鎖DNA結合の有無がMukBとMukFの相互作用に及ぼす影響を比較することでこれを検証する。2023年度は、精製MukBタンパク質、精製MukEF複合体タンパク質、一本鎖DNAを用いたDNA結合実験を実施した。MukEF複合体がMukBと一本鎖DNAとの結合も阻害すること、また、精製したMukEF複合体が一本鎖DNAと結合することを新たに見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
(A)の実験計画について、2023年度は大腸菌細胞内でのrDNA同士の近接を顕微鏡で観察する実験系を構築した。米国ウィスコンシン大のRichard L. Gourse博士に連絡を取って大腸菌株の分与を受け、本研究で用いる大腸菌系統へと実験システムを移植した。蛍光タンパク質の発現条件等を最適化し、染色体上の2箇所のrDNA同士の近接を蛍光顕微鏡で観察することに成功した。また、rDNA領域の近接を観察可能な株へのmukB欠失変異の導入も完了した。2023年度に実施予定であった精製MukBタンパク質と磁気ビーズを混合して顕微鏡で観察する実験は準備を終えたものの実験には着手できていない。
(B)の計画において、「一本鎖DNA結合によりMukBの構造状態が変化する」という仮説は、一本鎖DNA結合能が低下したMukB変異体の分子内サプレッサー解析で得られた結果が一つの根拠となっている。取得したサプレッサー型MukBを精製して生化学実験を行う予定であったが、タンパク質精製装置の不調などがありやや滞った。一方で、MukEF複合体が二本鎖DNAとMukBの結合を阻害するだけでなく、一本鎖DNAとMukBの結合も阻害することを見いだした。また、これまでの生化学実験からはMukBEFのうちDNA結合能を有しているのはMukBだけであるとされていたが、精製したMukEF複合体が一本鎖DNAと結合することを新たに見出した。
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| Strategy for Future Research Activity |
「(A)一本鎖DNAに結合したMukBEF複合体によるDNA凝縮の検出」に関しては、以下の実験を実施する。(A)-1：一本鎖DNAまたは二本鎖DNAを結合した直径1 μmのビーズを準備し、精製したMukBタンパク質を加える。MukBによるDNAの凝縮をビーズ同士の近接として評価する。(A)-2：細胞内で一本鎖DNAが生じている領域としてrDNA領域に着目する。2023年度に作製した、2つの異なるrDNA領域をparS/mCherry-ParB及びparS/msfGFP-ParBでそれぞれ標識可能な大腸菌株を用いて、MukBによるrDNA領域同士の近接を検出する。(A)-1による生化学実験と(A)-2による生細胞を用いた実験により、in vitro 及び in vivo 両面からMukBによるDNA凝縮の機構を明らかにする。
「(B)一本鎖DNA結合後のMukBの構造状態の解析」に関しては以下の実験を実施する。(B)-1：まずMukBとMukFの相互作用領域にシステイン残基を導入した変異体を作製し、ケミカルクロスリンカーで処理することでMukB-MukF相互作用を検出する。次に、検出したMukB-MukF相互作用が一本鎖DNA及び二本鎖DNAの存在下でどのように変化するかを解析する。(B)-2：一本鎖DNAとの相互作用が低下したMukB(K75E)変異体の分子内サプレッサー変異体を本年度までに多数取得した。これらの変異体をHisタグを用いて精製し、一本鎖DNA結合能と種々の条件下でのMukFとの相互作用を解析する。
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