| Project/Area Number |
22K15097
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 44010:Cell biology-related
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
佐々木 妙子 群馬大学, 生体調節研究所, 助教 (90933507)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | ミトコンドリア / 母性遺伝 / マイトファジー |
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| Outline of Research at the Start |
ミトコンドリアは、生体内でエネルギーを産生する重要な細胞小器官であり、独自のDNAであるミトコンドリアDNA（mtDNA）をもつ。核DNAとは異なり、mtDNAは片親のみから受け継がれることが知られている。このような特殊な遺伝様式はほとんどの真核生物でみられるにも関わらず、その分子メカニズムはいまだに未解明である。最近になり母性遺伝の仕組みとして、受精後の父性ミトコンドリアがオートファジーによって選択的に分解されることが示された。本研究では、なぜ父性ミトコンドリアだけが周囲の母性オルガネラと区別され、選択的にオートファジーに導かれるのか、その分子メカニズムの解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ほとんどの真核生物でミトコンドリアDNA (mtDNA) は片親遺伝、主に母性遺伝する。近年、受精後の父性ミトコンドリア（父性mt）と内部のmtDNAのオートファジーによる分解が線虫C. elegansで初めて示された。本研究では、父性mtだけが選択的にオートファジーに導かれる分子メカニズムを、イメージング・プロテオミクス・遺伝学的手法を駆使して解明を目指す。
これまでの解析から、父性mtの分解にはALLO-1とIKKE-1が必須の因子であることが分かっていた。しかし、ALLO-1が父性mtに局在化するメカニズムやIKKE-1の役割は分かっていなかった。昨年度までに、ライブイメージングにより、ALLO-1が受精直後に父性mtを認識し局在化することを明らかにしてきた。また、ALLO-1による認識後、IKKE-1を介してオートファジーの開始に必要な因子、およびALLO-1が父性mtへさらに集積していくことが、オートファジーの駆動に必須であることも明らかにした。本年度は、超解像顕微鏡FV3000-OSRを用いることで、ikke-1遺伝子欠損胚においてオートファゴソーム形成が途中で停止してしまうことなどを見出し、これらの知見をまとめて国際誌（Nature Communications）に発表した。IKKE-1は、ヒトなど哺乳類において機能不全に陥った不良ミトコンドリアをオートファジーで除去する際に働く、TBK1/IKKεのホモログであることから、本発見は、母性遺伝だけでなく、ヒトにおいて疾患や老化の原因ともなる不良ミトコンドリアの除去の仕組みの解明にもつながることが期待される。
また本年度は、父性mt選択的オートファジーに関与する因子の探索、および精子ミトコンドリアの組成を解析するためのツールの開発もおこなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、①オートファジーに先立って起こる父性mtの変化、②ALLO-1が父性mtを認識するメカニズム、③その他の因子の役割の同定と解明を通じて、父性mt特異的オートファジーの分子メカニズムを解明することを目的としている。それぞれにおける進捗状況は以下の通りである。
①オートファジーに先立って起こる変化を解明するために、精子からミトコンドリアを単離し、他組織のものと組成を比較しようとしている。単離方法を検討した結果、精子、および受精卵から、ミトコンドリアを高純度で分画することに成功した。
②昨年度までに、計画に従ってGFP-ALLO-1を発現した線虫の受精卵を単離し、PFAで架橋したのち、免疫沈降法を用いてALLO-1結合因子を網羅的に同定した。しかし、ALLO-1の局在化に大きく影響を与える因子は見いだせなかった。そこで本年度は、ビオチンリガーゼであるTurboIDを用いて近接依存性標識法によるALLO-1相互作用因子の探索をおこなった。その結果、前回の解析では得られなかった因子を多数同定することに成功した。
③本年度は、ALLO-1の相互作用因子であるIKKE-1の機能を詳細に解析した。昨年度までにikke-1欠損胚において、ALLO-1やオートファジーの初期を駆動する因子の局在化が非常に弱くなることから、IKKE-1がこれらの因子の集積を促進していることが分かっていた。本年度は、ikke-1欠損胚における父性mt選択的オートファジーの後半における影響を調べた。その結果、ikke-1欠損胚では、オートファゴソームの形成が途中で停止することが、超解像顕微鏡などを用いた解析から明らかになった。したがって、IKKE-1によるオートファジー因子の集積は、オートファゴソームの伸長に必須であると考えられる。これらの知見をまとめ、論文を国際誌に発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、主に受精後に父性mtおよびその周辺に起こる変化について解析、および報告したため、最終年度は、①オートファジーに先立って起こる父性mtの変化、②ALLO-1が父性mtを認識するメカニズムに重点を置いて解析を進める。
①オートファジーに先立って起こる父性mtの変化：本年度は、精子および受精卵から、ミトコンドリアを単離することに成功した。今後は、膜電位依存的にミトコンドリアを赤く染色することが可能な色素TMREを用いて、単離ミトコンドリアの状態が良好かどうかを調べる。その後、ラージスケールでミトコンドリアを単離し、比較プロテオミクス解析をおこなう予定である。また、イメージングによっても精子mtの変化を捉えるために、蛍光色素を用いたミトコンドリア内部構造の可視化を引き続き進める予定である。
②ALLO-1が父性mtを認識するメカニズム：本年度は、あらたにTuuboIDを用いた近接依存性標識法により、ALLO-1に近接した因子を網羅的に同定した。これらの候補因子の中には、これまでに解析していない因子が多数含まれているため、今後RNAiにより網羅的スクリーニングをおこない、ALLO-1の局在化に影響を与える因子を探索する予定である。
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