TGF-βシグナル伝達に関わる核膜蛋白質の小胞体－核輸送制御の解析

• Project/Area Number: 22K15128
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 44020:Developmental biology-related
• Research Institution: Teikyo University
• Principal Investigator: 佐藤 夢子 (小林夢子) 帝京大学, 先端総合研究機構, 助教 (00756447)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2025: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
• Keywords: Lemd3 / 核-細胞質間輸送 / 核膜蛋白質 / 細胞内局在 / 小胞体-核輸送 / TGF-βシグナル / 中胚葉分化 / 発生生物学

Outline of Research at the Start

Lemd3は核内膜に局在し、TGF-β経路の下流で作用する転写因子のSmadを核膜近傍に捕捉することで、シグナル伝達を抑制すると考えられている。しかし、どのようにLemd3の動態がアクチビンに応じて変化するのか、またLemd3の局在変化が下流の遺伝子発現やシグナル伝達にどのような影響を及ぼすのか、その詳細な分子機構と生物学的意義は分かっていない。本課題ではアクチビンによるLemd3の小胞体－核輸送制御に着目し、その実体を明らかにする事で、核膜蛋白質の局在変化がもたらすシグナル伝達と胚発生への影響を新たに明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

核内膜蛋白質のLemd3は、TGF-β経路の下流で作用する転写因子のSmadを核膜近傍に捕捉することで、シグナル伝達を抑制すると考えられている。しかしLemd3の細胞内局在を細かく観察すると、核膜だけではなく細胞質中の膜小胞にも滞留することが見出された。そこで、Lemd3の細胞内局在変化が下流のシグナル伝達や胚発生にどのような影響を及ぼすのかを明らかにすることにした。
TGF-β/アクチビン存在下のLemd3の局在変化を検討するため、蛍光蛋白質のVenusを繋げたLemd3（Venus-Lemd3）をアフリカツメガエル初期胚に発現させ、アクチビン存在下での細胞内局在を、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。その結果アクチビン処理を行うことで、Lemd3の膜小胞局在が増加する事が確認できた。
また、細胞膜と核を蛍光蛋白質でトレースして、アクチビン処理による核と細胞質の体積比 (N/C ratio) の変化を検討した。その結果、アクチビン処理群はコントロールと比較して、核サイズが縮小する可能性が示唆された。これは、アクチビン処理によって、核構成物質や核膜蛋白質の核内輸送が抑えられた、もしくは核外輸送が促進された可能性が考えられる。現在、Lemd3の膜小胞局在制御機構を検討するために、核-細胞質間輸送に関わるRan蛋白質との共局在や、Ran蛋白質変異体を用いた解析を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

TGF-β/アクチビン存在下のLemd3の局在変化は検討済みである。 現在、ラミン、BAF、ヒストンなどの核構成蛋白質や、核輸送分子RanとLemd3の細胞内共局在を検討している。 また、Lemd3の膜小胞が、どのオルガネラに組み込まれるかを確認するため、小胞体やリソソームなどに対する特異抗体（抗Calnexin、抗LAMP1/2）を用いて免疫染色を行っている。ツメガエル胚を用いた免疫染色では、上手く染まらない抗体があるため、免疫染色の至適条件を慎重に模索している。現在までの進捗状況は、おおむね予定通りである。

Strategy for Future Research Activity

今後は、過型電子顕微鏡を用いて、核膜や小胞体などの膜オルガネラの微細構造を確認し、アクチビン存在下での変化を検討する予定である。
また、TOR1AIP2、CTDNEP1/Dullardといった、膜小胞輸送に関わる分子の機能亢進・阻害実験も予定している。まず、アクチビンによるLemd3の局在変化に影響を及ぼすかを、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察し、標的遺伝子への影響は、qRT-PCRや全胚ISH、TGF-β特異的ルシフェラーゼレポーターアッセイなどで確認する。