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ゼニゴケ精子変態期のライブイメージング手法の確立と細胞内分解系の役割の解明

Research Project

Project/Area Number 22K15149
Research Category

Grant-in-Aid for Early-Career Scientists

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section Basic Section 44030:Plant molecular biology and physiology-related
Research InstitutionKumamoto University (2023)
National Institute for Basic Biology (2022)

Principal Investigator

南野 尚紀  熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 特任助教 (20823256)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
Keywords膜交通 / 有性生殖 / 雄性配偶子 / ライブイメージング / ゼニゴケ / 精子 / イメージング
Outline of Research at the Start

タイ類を含む陸上植物の一部の系統では,雄性配偶子として運動能をもつ精子を形成する.精子形成過程ではダイナミックな細胞形態の変化が起こるが,それを制御する分子メカニズムについては未解明な点が多い.
これまでにタイ類ゼニゴケを用いた解析により,精子変態期においてエンドサイトーシスやオートファジーといった細胞内分解系が亢進することが見出されていた.本研究では,これら細胞内分解系が精子変態期においてどのような役割を果たすのかを,新たに確立するライブイメージング手法を主軸として明らかにすることを目指す.

Outline of Annual Research Achievements

コケ植物を含むいくつかの植物の系統では雄性配偶子として動物と同様に運動性の精子が形成される。本研究ではコケ植物ゼニゴケをモデルとして,精子変態期に起こる細胞内ダイナミクスを制御する仕組みについて,ライブイメージング系の確立と細胞内分解系の役割に特に注目した解析を進めている。
昨年度に検討した培養条件で造精器のイメージングを行った結果,活発なエンドサイトーシスによる細胞膜タンパク質の取り込みをライブで観察することに成功した。
精子変態期における活発なエンドサイトーシスの制御機構をさらに詳細に調べるため,エンドサイトーシスにおいて積荷タンパク質の選別にかかわるPICALMファミリーに着目した。ゼニゴケにはPICALMファミリーに属するタンパク質は3つある。そのうちMpPICALM-Kと名付けたタンパク質はC末端側にキナーゼドメインをもつというこれまでにない特徴がみられた。MpPICALM-Kの機能を調べるため,分子遺伝学的解析に加え,Alphafold2を用いたタンパク質立体構造予測や深層学習モデルを用いた表現型解析を行った。その結果,MpPICALM-Kは精子変態期でのエンドサイトーシスの亢進により起こる細胞膜タンパク質の分解には関与しない一方で,精子変態期のある時期において鞭毛の基部に局在し,精子の運動機能に関与する可能性が見出された。
エンドサイトーシスにより分解されるタンパク質と分解されずに成熟精子に残るタンパク質とを選別する仕組みに迫るため,成熟精子の細胞膜タンパク質の候補をオミクスデータを元に選択した。選択した候補因子の局在観察を進めている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2023年度の初期は異動に伴って栽培条件および培養条件の再検討を行う必要があり,研究計画の進行について全体的に遅れが生じた。
再検討した培養条件で細胞膜タンパク質の動態を観察した結果,エンドサイトーシスによる細胞膜の取り込みを約24時間程度ライブで観察することに成功した。ライブイメージング系の確立に向けて進展がみられた一方で,成功率はまだあまり高くなく,長時間の観察にも至っていないため,もう少し培養と観察条件の検討が必要である。細胞膜タンパク質に加えて鞭毛マーカータンパク質の観察も行ったが,蛍光退色が早くうまく観察ができなかった。現在より安定な蛍光タンパク質へ繋ぎ変えたものを準備中である。
エンドサイトーシスにおいてアダプタータンパク質としてはたらくPICALMファミリーに注目し解析を行った。ゼニゴケには3つのPICALMタンパク質があるが,そのうちMpPICALM-Kと名付けたものは,C末端側にキナーゼドメインをもつ植物特異的なPICALMタンパク質であることがわかった。機能解析の結果,MpPICALM-Kは精子変態期における細胞膜タンパク質の分解には関与しない一方で,鞭毛基部に局在し精子の運動機能に関わるという興味深い結果を得ることができた。精子変態期における細胞膜タンパク質分解の制御システムについてはさらに調べるべき点も多く,更なる検証を進めたい。

Strategy for Future Research Activity

ライブイメージング系について,長時間かつ安定した結果が得られる培養・観察条件の検証を引き続き進める。現在ライブでの観察ができつつある細胞膜タンパク質の動態について、BFAなどの薬剤処理条件での動態観察なども行い,その影響について調べ,ライブイメージング系の有効性を示す。その他のマーカーについて,一部については退色しにくい蛍光タンパク質につなぎ変えたものの形質転換株の作出なども行いながら,観察を進めていく。
精子変態期におけるエンドサイトーシスの制御機構についても引き続き調べる。エンドサイトーシス制御因子のうち雄性生殖器で発現がみられるものを探索する。注目すべき因子については変異体を作出し,エンドサイトーシスマーカーの挙動の観察や精子の運動性の評価などの表現型解析を行う。細胞内局在についても観察を行う。MpPICALM-Kについても,精子運動への具体的な寄与についてさらに検証する。
上記に関連して,成熟精子の細胞膜に局在するタンパク質についても引き続き探索する。いくつかの候補因子について,局在解析を進める。成熟精子の細胞膜タンパク質に局在が観られたタンパク質について,分解されるものと比較を行い,分解の選択性が生じる仕組みを検証する。

Report

(2 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • Research Products

    (10 results)

All 2024 2023 2022

All Journal Article (7 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 7 results,  Open Access: 6 results) Presentation (3 results)

  • [Journal Article] A non-canonical BZR/BES transcription factor regulates the development of haploid reproductive organs in Marchantia polymorpha2024

    • Author(s)
      Furuya Tomoyuki、Saegusa Natsumi、Yamaoka Shohei、Tomoita Yuki、Minamino Naoki、Niwa Masaki、Inoue Keisuke、Yamamoto Chiaki、Motomura Kazuki、Shimadzu Shunji、Nishihama Ryuichi、Ishizaki Kimitsune、Ueda Takashi、Fukaki Hidehiro、Kohchi Takayuki、Fukuda Hiroo、Kasahara Masahiro、Araki Takashi、Kondo Yuki
    • Journal Title

      Nature Plants

      Volume: - Issue: 5 Pages: 785-797

    • DOI

      10.1038/s41477-024-01669-0

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Analysis of Plant-Specific ANTH Domain Containing Protein in Marchantia polymorpha2023

    • Author(s)
      Minamino Naoki、Fujii Haruki、Murata Haruhiko、Hachinoda Sho、Kondo Yohei、Hotta Kazuhiro、Ueda Takashi
    • Journal Title

      Plant And Cell Physiology

      Volume: 64 Issue: 11 Pages: 1331-1342

    • DOI

      10.1093/pcp/pcad118

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Autophagy regulates plastid reorganization during spermatogenesis in the liverwort Marchantia polymorpha2023

    • Author(s)
      Norizuki Takuya、Minamino Naoki、Sato Miyuki、Ueda Takashi
    • Journal Title

      Frontiers in Plant Science

      Volume: 14 Pages: 1-8

    • DOI

      10.3389/fpls.2023.1101983

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Remodeling of organelles and microtubules during spermiogenesis in the liverwort Marchantia polymorpha2022

    • Author(s)
      Minamino Naoki、Norizuki Takuya、Mano Shoji、Ebine Kazuo、Ueda Takashi
    • Journal Title

      Development

      Volume: 149 Issue: 15 Pages: 1-14

    • DOI

      10.1242/dev.200951

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Phylogenetic distribution and expression pattern analyses identified a divergent basal body assembly protein involved in land plant spermatogenesis2022

    • Author(s)
      Koshimizu Shizuka、Minamino Naoki、Nishiyama Tomoaki、Yoro Emiko、Sato Mayuko、Wakazaki Mayumi、Toyooka Kiminori、Ebine Kazuo、Sakakibara Keiko、Ueda Takashi、Yano Kentaro
    • Journal Title

      New Phytologist

      Volume: 236 Issue: 3 Pages: 1182-1196

    • DOI

      10.1111/nph.18385

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Dynamic rearrangement and autophagic degradation of mitochondria during spermiogenesis in the liverwort Marchantia polymorpha2022

    • Author(s)
      Norizuki Takuya、Minamino Naoki、Sato Miyuki、Tsukaya Hirokazu、Ueda Takashi
    • Journal Title

      Cell Reports

      Volume: 39 Issue: 11 Pages: 110975-110975

    • DOI

      10.1016/j.celrep.2022.110975

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Membrane trafficking functions of the ANTH/ENTH/VHS domain‐containing proteins in plants2022

    • Author(s)
      Feng Yihong、Hiwatashi Takuma、Minamino Naoki、Ebine Kazuo、Ueda Takashi
    • Journal Title

      FEBS Letters

      Volume: 596 Issue: 17 Pages: 2256-2268

    • DOI

      10.1002/1873-3468.14368

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] ゼニゴケ精子運動パターンの新規定量解析手法の構築2024

    • Author(s)
      南野尚紀,檜垣匠
    • Organizer
      第65回日本植物生理学会年会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 基部陸上植物タイ類ゼニゴケにおけるESCRT-III複合体の機能解析2022

    • Author(s)
      南野尚紀、法月拓也、真野昌二、海老根一生、上田貴志
    • Organizer
      第64回日本植物生理学会年会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] イメージング・AI技術を駆使して植物精子の形成と運動の仕組みを理解する2022

    • Author(s)
      南野尚紀、法月拓也、藤井春樹、八野田奨、海老根一生、真野昌二、堀田一弘、上田貴志
    • Organizer
      日本植物学会第86回大会
    • Related Report
      2022 Research-status Report

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Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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