| Project/Area Number |
22K15324
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 47060:Clinical pharmacy-related
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| Research Institution | Takasaki University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
長嶺 歩 高崎健康福祉大学, 薬学部, 講師 (00882622)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | ワルファリン / GGCX / ビタミンK / 凝固因子活性 / プロテオミクス / 凝固活性 |
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| Outline of Research at the Start |
ワルファリン（WF）の薬効予測のために多くの研究が実施されてきたが、効果規定因子の約40%は不明のままである。過去の研究ではPT-INRを用いて効果規定因子を探索しているため、未解明の個人差の要因がビタミンKサイクルから血液凝固のどの過程にあるのかが不明である。WFはGGCXの活性低下を介して薬効を示すため、本研究ではビタミンKサイクル内の各因子によりGGCX活性を規定できるか、およびGGCX活性により凝固活性を規定できるかを分けて評価することで未解明の効果規定因子がどの過程にあるかを明らかにする。さらに個人差の過程に関連するタンパク質のプロテオミクスにより新規WF効果規定因子の検出を試みる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ワルファリン（WF）の薬効予測のために多くの研究が実施されてきたが、効果規定因子の約40%は不明のままである。過去の研究ではPT-INRを用いて効果規定因子を探索しているため、未解明の個人差の要因がビタミンK（VK）サイクルから血液凝固のどの過程にあるのかが不明である。WFはγ-グルタミルカルボキシラーゼ（GGCX）の活性低下を介して薬効を示すため、本研究ではVKサイクル内の各因子によりGGCX活性を規定できるか、およびGGCX活性により凝固活性を規定できるかを分けて評価することで未解明の効果規定因子がどの過程にあるかを明らかにする。さらに個人差の過程に関連するタンパク質のプロテオミクスにより新規WF効果規定因子の検出を試みる。当該年度では以下の検討を実施した。
1）VKサイクル内の因子とGGCX活性との相関の検討
既知WF効果規定因子であるCYP2C9、CYP2C19、CYP4F2、VKORC1、GGCXおよびAPOEの遺伝子変異と、関連因子であるVK（phylloquinone、menaquinone-4）、WFおよびPIVKA-Ⅱの血中濃度について、対象患者108人分の分析を終了した。また、LC-MS/MSを用いたGGCX活性の評価手法についてはIn-vitroの検討を終了させ、患者検体を用いた前処理の検討を実施している。
2）GGCX活性とVK依存性タンパク質（VKDP）の凝固因子活性の相関の検討
対象患者108人分の血液凝固因子（第Ⅱ、第Ⅶ、第Ⅸ及び第Ⅹ因子）の凝固活性の分析を終了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
対象患者108人のVKサイクル内の関連因子（遺伝子変異、血中WF濃度、血中VK濃度、血中PIVKA-Ⅱ濃度）の分析は終了している。さらに、対象患者108人の凝固因子（第Ⅱ因子、第Ⅶ因子、第Ⅸ因子、第Ⅹ因子）活性についても分析は終了している。既知因子と患者背景因子の関連でWFの薬効解明に重要な知見を見出し、研究成果を論文投稿中である。
現在はGGCX活性の評価手法確立のための検討を実施している。GGCX活性の強さに応じて、VKDPの凝固因子は段階的にN末端領域からグルタミン酸残基がγ-カルボキシグルタミン酸残基に変換（Gla化）されることが報告されている。そのため、GGCX活性を評価するため、プロトロンビンのGla化する部位を含む特異的なペプチド配列を6種類合成し、LC-MS法による分析系を確立した。しかしながら、生体試料を用いると夾雑物質の影響を受けるため、前処理法の検討を実施している。
上記検討が終了次第、「VKサイクル内の因子とGGCX活性との相関の検討」および「GGCX活性とVKDPの凝固因子活性の相関の検討」に着手する。
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| Strategy for Future Research Activity |
患者検体におけるGGCX活性の評価手法確立のため、前処理の検討をすすめる。
GGCX活性評価のために合成したペプチド配列6種類について、前処理後の該当ペプチドのピーク強度のばらつきが大きいことと、感度不足で解析できない場合があるため、感度上昇のため濃縮効率が改善するよう濃縮キットを用いた検討等を実施予定である。分析したペプチドのピーク強度と既に分析している血中PIVKA-Ⅱ濃度およびGGCXの遺伝子変異との関連を調査し、GGCX活性評価手法としての妥当性を検証する。
上記検討後、既に分析済の既知因子とGGCX活性との関連を調査する。
さらに、GGCX活性と血液凝固能との間に乖離がある症例については血清プロテオミクスを用いてその要因を調査する。分析については高感度質量分析装置TripleTOF 6600を用いたSWATH解析の実施を検討している。なお、TripleTOF 6600を用いたSWATH分析については過去にも実施しており、技術的には確立できているため問題はない。
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