| Project/Area Number |
22K15345
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Review Section |
Basic Section 47060:Clinical pharmacy-related
|
|---|
| Research Institution | Tokyo University of Science (2023)
Takasaki University of Health and Welfare (2022) |
|---|
Principal Investigator |
張 協義 東京理科大学, 研究推進機構総合研究院, プロジェクト研究員 (60878510)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
|
| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
|
|---|
| Keywords | 上皮間葉転換 / 間葉上皮転換 / 多剤耐性 / 足場タンパク質 / P-糖タンパク質 / 薬物排出系トランスポーター / 転写調節因子 / 足場タンパク |
|---|
| Outline of Research at the Start |
がん転移は原発巣の上皮系がん細胞が間葉系がん細胞へと形質転換する現象EMTと、その間葉系がん細胞が転移先の組織に定着して上皮系細胞に戻る現象METの２段階のプロセスにより成立する。我々はすでに、EMTを惹起した肺がん細胞においては薬物排出TPの活性が上昇し、がん細胞の薬剤耐性が亢進することを明らかにしている。本研究では、EMTの誘導に伴って亢進したがん細胞の排出系TPの機能が、METを誘導した時にも保持されているのか、あるいは変動するのかを明らかにすること、およびそのメカニズムを解明し、がん細胞転移時のEMT/METの一連の過程における薬剤耐性の変動を明らかにすることを目的とする。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
がんの転移は、原発巣の上皮細胞が間葉細胞に形質転換する現象(EMT)と、転移先の組織に定着して上皮細胞に戻る現象(MET)の2段階のプロセスにより成立する。腫瘍の転移は多剤耐性(MDR)に関与することが知られている。MDRの原因の一つは、P-糖タンパク質（P-gp）などの薬物排出系トランスポーターの発現の増加である。一方、薬物排出系トランスポーターの発現にはそのトランスポーターを細胞膜上に固定する足場タンパク質が重要であり、肺がんではEzrin（Ezr）とMoesin（Msn）がP-gpの足場タンパク質であることが知られている。本研究では、EMT/MET誘導肺がん細胞においてP-gpの機能変化およびそのメカニズムを解明することを目的とした。
HCC827肺がん細胞をSnailまたはDexamethasone（DEX）で処理し、EMTおよびMETを誘導した。また、Snail処理後のDEX処理によって連続的にEMTとMETを誘導した。RT-PCRによるmRNA発現を定量し、膜タンパク質をWestern Blottingによって定量した。さらにRhodamine123を用いて活性を、Paclitaxelを用いて毒性を検討した。
EMTの場合、MsnのmRNAとタンパク質発現が増加し、P-gpの膜発現と活性が上昇した。METの場合、EzrとP-gpのmRNAおよび膜発現は増加し、P-gpの活性が上昇した。両方を誘導した場合、P-gpの膜発現はより顕著に上昇した。すなわち、EMTにおけるP-gpの活性はMsnによって制御され、METにおけるP-gpの活性はEzrによって制御されている可能性が示唆された。また、これらの制御は、EMT/METを連続的に誘導したとき相乗的であることが示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2023年度は当初の計画通り、「あらかじめ転写調節因子のプラスミドDNAを導入してEMTを誘導したHCC82細胞を用いて、MET誘導因子をHCC827細胞に添加・導入して、P-gpのmRNAおよび細胞内総タンパク質発現量、活性を測定する。細胞内総タンパク質量が変動しないにも関わらず活性が上昇する場合は、P-gpの細胞膜画分におけるタンパク質量および足場タンパク質のmRNA量を測定する」した。我々は、EMTおよびMET両方を誘導した場合、P-gpの膜発現はより顕著に上昇した。すなわち、EMTにおけるP-gpの活性はMsnによって制御され、METにおけるP-gpの活性はEzrによって制御されている可能性が示唆された。また、これらの制御は、EMT/METを連続的に誘導したとき相乗的であることが示唆された。
DEXを処理したとき、EzrおよびP-gpのmRNA量はコントロールに比べて有意に増加した。RdxおよびMsnのmRNAの発現量には統計学的差異が認められなかった。WBの結果によると、EzrとP-gpのタンパク質膜発現量が有意に増加した。さらに、P-gpの機能を評価した。P-gpの蛍光基質Rho123のEfflux実験および基質Paclitaxel添加した細胞生存率実験を行った。METを誘導した肺がん細胞のRho123排出率がコントロールと比べて有意に増加した。また、Paclitaxelを加えた時、METを誘導した細胞の細胞生存率はコントロールと比べて有意に増加した。このことから、肺がん細胞におけるP-gpの機能はDEXによって増強された可能性が示唆された。以上の結果を踏まえて、論文を投稿し、発表された。
|
| Strategy for Future Research Activity |
すでに、SnailによるEMT肺がん細胞におけるP-gpが活性化され、それはMsnによって制御されている可能性が示唆された。本研究では、DEXがMETを誘導することができるを確認されて、肺がんにおけるDEX→Ezr→P-gp連関系の存在を明らかにした。DEXによるMET肺がん細胞におけるP-gp発現量と活性が上昇し、それはEzrによって制御されている可能性も示唆された。これまでの結果を踏まえて論文を発表された。
さらに、EMT→MET両方を誘導した場合、P-gpの膜発現はより顕著に上昇した。すなわち、EMTにおけるP-gpの活性はMsnによって制御され、METにおけるP-gpの活性はEzrによって制御されている可能性が示唆された。また、これらの制御は、EMT/METを連続的に誘導したとき相乗的であることが示唆された。
今後、「In vivoの検討においては、マウスの右腋窩線上の横隔膜・腋窩間胸壁に肺がん細胞を注入後、体重の減少を指標に最大10週間飼育観察し、リンパ節転移マウスモデルを作製する（研究計画調書記載）」を進める。さらに、この動物から採取した原発巣および転移巣の細胞を必要に応じて培養し、EMTおよびMETに関わるマーカーの発現差を確認するとともに、排出系TPのmRNA発現量、タンパク質の発現量および活性を測定する。
In VitroとIn Vivoの実験結果を合わせて考察し、論文を作成して投稿する予定である。
|
