Project/Area Number |
22K15357
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Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Review Section |
Basic Section 48010:Anatomy-related
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Research Institution | Kagoshima University |
Principal Investigator |
久住 聡 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (00758039)
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Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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Keywords | ゴルジ体 / 分裂期 / 走査電子顕微鏡 / 連続切片SEM法 / 光電子相関顕微鏡法 / オスミウム浸軟法 / ゴルジ装置 / 分裂期動態 |
Outline of Research at the Start |
細胞分裂時のゴルジ装置動態は、主に蛍光観察によって解析されてきたが、電子顕微鏡(電顕)レベルの三次元構造解析は未だ不十分である。そこで本研究では、申請者らが開発した先端的な3Dイメージング技法により、in vitro環境におけるゴルジ装置の分裂期分配様式を三次元形態学的に再検討し、その機能構造的意義を明らかにする。具体的には、HeLa細胞とHEK293細胞に対し、走査電顕(SEM)オスミウム浸軟法と連続切片SEM法による包括的3D微細形態解析を行い、さらに光電子相関顕微鏡法(CLEM法)を駆使することで、分裂期に見られるゴルジ装置のダイナミクスをゴルジ関連分子の局在と結び付けて詳細に解明する。
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Outline of Annual Research Achievements |
これまで、細胞周期やゴルジ体の判別は走査電子顕微鏡(SEM)による形態解析を中心に行ってきたが、前年度までの結果から、より正確な解析には細胞内の分子局在情報が必要不可欠であることが示されてきた。本年度の研究では、蛍光観察した培養細胞において、SEMにより光電子相関顕微鏡(CLEM)法を行う手法を確立することに成功した。これにより、間期と分裂期の培養細胞(HeLa細胞)について、ゴルジ体の3D形態解析を進めた。 ①Volume-CLEM法による解析:目的分子を蛍光標識した培養細胞を光学顕微鏡観察し、樹脂包埋した同一細胞から連続超薄切片を作製、SEM観察することで、得られたすべての連続SEM像においてCLEM解析する手法(Volume-CLEM法)を確立した。これにより、これまで形態情報を中心に行ってきた連続超薄切片SEM立体再構築法(連続切片SEM法)に分子局在情報を加味することが可能となった。 ②Fucciによる細胞周期の判別とGolgi関連分子の蛍光標識:上記Volume-CLEM法において細胞周期モニタリング標識Fucciを用いることで、蛍光情報から細胞周期を判別し、より効率的に間期と分裂期の形態解析を進めることができた。また、Golgi関連分子(GM130、TGN46、ST、ERGIC53など)を蛍光標識しVolume-CLEM解析することで、断片化したゴルジ体についても判別することが可能となった。さらに、これらの情報を元にした3D形態解析法(3D-CLEM法)を確立し、間期と分裂期のHeLa細胞についてゴルジ体の3Dモデルの作製を進めてきた。今後は、これらの3Dモデルを拡充し、より一般化したゴルジ体モデルの解明を行っていく予定である。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、分裂期の培養細胞におけるゴルジ体動態について、その形態的特徴と機能的意義を三次元的に明らかにすることを目的としている。前年度までの結果により、分裂期において断片化したゴルジ体を正確に判別するためには、SEM像と分子局在情報との組み合わせが必要不可欠であることが示されてきた。2023年度では、培養細胞の蛍光像とSEMによる連続超薄切片像を組み合わせたCLEM法(Volume-CLEM法)と、そこから得られた3Dモデル解析法(3D-CLEM法)について確立することができた。これにより、効率的な細胞周期の判別と、各細胞周期における正確なゴルジ体の3D形態解析が可能となり、現在はHeLa細胞のゴルジ体について順調に解析を進めている。
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Strategy for Future Research Activity |
2023年度に確立したVolume-CLEM法、3D-CLEM法を用い、HeLa細胞のゴルジ体について、より詳細な解析を進めるとともに、他の培養細胞(Hek293細胞、Expi293細胞など)についても解析を行っていく。さらに、より精密な分子局在情報を得るため、連続切片SEM法に免疫電顕法を組み合わせた手法についても開発を進める予定である。本研究では特に、①従来の金コロイド免疫電顕法、②近接依存性標識を用いたオスミウムブラック法、について検討を行っている。 これらの手法によって、各細胞周期のゴルジ体モデルを詳細に解析するとともに、分裂期動態のメカニズムについても検討を進めていく予定である。
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