| Project/Area Number |
22K15357
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 48010:Anatomy-related
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
久住 聡 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (00758039)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | ゴルジ装置 / 分裂期 / 走査電子顕微鏡 / 連続切片SEM法 / 光電子相関顕微鏡法 / 免疫電顕法 / ゴルジ体 / オスミウム浸軟法 / 分裂期動態 |
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| Outline of Research at the Start |
細胞分裂時のゴルジ装置動態は、主に蛍光観察によって解析されてきたが、電子顕微鏡(電顕)レベルの三次元構造解析は未だ不十分である。そこで本研究では、申請者らが開発した先端的な3Dイメージング技法により、in vitro環境におけるゴルジ装置の分裂期分配様式を三次元形態学的に再検討し、その機能構造的意義を明らかにする。具体的には、HeLa細胞とHEK293細胞に対し、走査電顕(SEM)オスミウム浸軟法と連続切片SEM法による包括的3D微細形態解析を行い、さらに光電子相関顕微鏡法(CLEM法)を駆使することで、分裂期に見られるゴルジ装置のダイナミクスをゴルジ関連分子の局在と結び付けて詳細に解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くの脊椎動物細胞では、ゴルジリボンが繋がって細胞質内で一つの大きなゴルジ装置を形成しているが、分裂期ではこれらが細分化・小胞化することが知られている。これまで行ってきた走査電子顕微鏡(SEM)による形態解析のみでは、細胞周期に伴うこれらの変化を正確にとらえるには不十分であり、ゴルジ装置に関連する機能分子局在とSEM像を結び付けた解析技法が必要であった。前年度までの結果により、蛍光観察した培養細胞において、連続切片SEM法と光電子相関顕微鏡法(CLEM法)を組み合わせたVolume/3D-CLEM法について確立した。この手法を用いて、Fucciによる細胞周期の判別とゴルジ装置関連分子の蛍光標識を施した培養細胞(HeLa細胞、Expi293細胞)において、各周期のゴルジ装置の三次元微細構造解析を進めてきた。一方、より精密な機能分子局在情報を得るために、免疫電顕法との組み合わせが必要となることが分かってきた。本年度の研究では、連続切片SEM法に①近接依存性標識、②金コロイド免疫電顕法、をそれぞれ組み合わせた手法の開発を行った。
①近接依存性標識を用いたオスミウムブラック法：ゴルジ装置関連分子をAPEXによって標識した培養細胞について、固定後にDABによる発色を行い、オスミウムで後固定することでこれらの分子局在をSEM像で可視化した。これにより、各分子のゴルジ槽内での局在を連続切片SEM法による3Dモデル上に表示することに成功した。
②金コロイド免疫電顕法：ゴルジ装置関連分子を蛍光標識し、その蛍光蛋白に対する金コロイド免疫染色を施すことで、蛍光像と免疫電顕像を結び付けることを試みた。この際、細胞膜の透過処理として弱いDetergentを用いることで、染色性と電顕像の膜コントラストの両立を目指したが、最適な条件については現在検討段階である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、分裂期の培養細胞におけるゴルジ装置動態について、その三次元微細形態と機能的意義を明らかにすることを目的としている。前年度までの結果により、細胞周期に伴ったゴルジ装置の形態変化を可視化するためにはSEM像と分子局在情報の組み合わせが必要不可欠であり、その解析手法として蛍光3D像と連続切片SEM法を組み合わせたVolume/3D-CLEM法の開発を行った。本年度は、より詳細な機能分子局在情報の取得を目的に、連続切片SEM法と免疫電顕法を組み合わせた技法の開発を行ったが、最適な条件を得るにはさらなる検討が必要であり、これらの技法を用いた分裂期ゴルジ装置動態解析の進展が予定よりも遅れることとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年度に開発を進めた連続切片SEM法と免疫電顕法の組み合わせ技法を発展させ、より最適な条件検討を行う予定である。また、これらの技法を用いて各種培養細胞(HeLa細胞、Hek293細胞、Expi293細胞)の分裂期ゴルジ装置動態解析も進めていく。さらに、これらの結果と、Volume/3D-CLEMによって得られた結果について比較検討し、その成果として論文発表も行う予定である。
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