微小炎症ネットワークの解明に資する全身全細胞解析技術の開発

• Project/Area Number: 22K15435
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 49030:Experimental pathology-related
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 久保田 晋平 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 特任講師 (90808859)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: システム生物学 / 免疫学 / 組織透明化 / システムズバイオロジー / 全細胞解析 / 神経免疫連関

Outline of Research at the Start

申請者は慢性炎症性疾患の病態が固定化する前の超早期段階における医療介入・先制医療を実現するためには微小炎症の時空間的多様性・遷移状態 (微小炎症ネットワーク) を定量的に評価するための研究手法が必要であると考え、本研究において“微小炎症ネットワークの解明に資する全身全細胞解析技術の開発”に取り組む。
本研究で確立する網羅的な1細胞解像度での微小炎症解析技術は超早期段階における医療介入・先制医療を実現するための基盤技術となり、医学・生物学分野に対して広く波及効果を持つと期待される。

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、“微小炎症ネットワークの解明に資する全身全細胞解析技術の開発”である。これまで研究者らは炎症において重要な細胞・分子の同定に取り 組んできた。しかしながら技術的な限界により、慢性炎症性疾患の発端である微小炎症の時空間的多様性・遷移状態を理解することは依然として困難である。多種類の免疫細胞群によって惹起される微小炎症ネットワークの理解には分離された細胞を対象とする解析手法だけでは不十分であり、個体内の細胞の位置情報を保持した状態で細胞の機能情報を包括的に解析する手法が必要である。 本研究課題提案者は多細胞システムの解析基盤技術として組織透明化技術を用いた全細胞観察技術、マルチプレックスin situ ハイブリダイゼーション技術、マイクロエマルジョン技術を用いたオミクス解析に着目し研究を推進している。2023 年度は特に蛍光プローブの開発、マイクロエマルジョン技術を用いたオミクス解析に取り組み、金粒子を用いた微小炎症検出系の開発(Naim F et al. Bio Protoc. 2023 Apr 5;13(7):e4644.)、個体レベルでの低酸素状態の可視化手法の開発(Sakamoto et al., ACS Nano. 2024 Feb 13;18(6):5167-5179.)、GVHD（移植片対宿主病）予防薬であるカルシニューリン阻害薬が一過性（transitory）疲弊T細胞を誘導することで、逆慢性GVHDの発症してしまう機構の解明などを行った(Senjo et al., Calcineurin inhibitor inhibits tolerance induction by suppressing terminal exhaustion of donor T cells after allo-HCT. Blood. 2023 Aug 3;142(5):477-492.)。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究課題提案者はこれまでに個体内の細胞の位置情報・機能情報を包括的に解析する手法として組織透明化手法の開発を進めており、がん微小転移など個体に おいて非常に少数な細胞によって引き起こされる生命現象の定量的解析に成功している。2023年度は蛍光プローブの開発、マイクロエマルジョン技術を用いたオミクス解析に取り組み、金粒子を用いた微小炎症検出系の開発(Naim et al., Bio Protoc, 2023)、個体レベルでの低酸素状態の可視化手法の開発(Sakamoto et al., ACS Nano, 2024)、GVHD（移植片対宿主病）予防薬であるカルシニューリン阻害薬が一過性（transitory）疲弊T細胞を誘導することで、逆慢性GVHDの発症してしまう機構の解明などを行った。
特に個体レベルでの低酸素状態の可視化手法の開発に関しては1.組織透明化試薬(BABB, Basilified BABB, Acidified BABB, CUBIC-R, CUBIC-R+, Acidified CUBIC-R)における蛍光色素(FITC, TAMRA, SI-Rhodamine, Cy3, Cy5, Tokyo Green, Me-Si-Rhodol, Me-Si-Rhodamine, PO-Rhodamine, BODIPY)の光物性評価、2.蛍光標識したPimonidazoleの低酸素細胞の取り込み効率評価、3.個体における低酸素細胞の可視化を行うことで、個体レベルでの低酸素状態の可視化プローブとしてMe-Si-Rhodol標識Pimonidazole、BODIPY標識Pimonidazoleが利用可能であることを発表した。

Strategy for Future Research Activity

本研究では、多発性硬化症をモデルとして微小炎症の多次元的な発生・消滅・増幅・定着機構を解明するために、申請者らが開発してきた全身全細胞を1細胞解 像度で網羅的に観察するための組織透明化技術および大容量画像の解析技術を応用発展させ、新規微小炎症検出系、低酸素検出系を確立した。現在は、1.Click反応を応用することで個体レベルで生体情報を取得する方法の開発、2.酸化ストレスを検出するためのプローブ開発を行っている。これらの開発が進むことにより、微小炎症の発生からその増幅による慢性炎症への発展、その消滅による未病状態の維持まで、時空間的に微小炎症 ネットワークのダイナミクスを定量的に解明することが可能となると考えている。北海道においては再生医療に基づく新規治療法の実用化を目指す複数の企業が存在している。本技術は個体内に存在する微小炎症を定量的に評価することが可能であるため、微小炎症の制御による新規再生医療技術シーズの創出・検証に貢献が可能であると考えている。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Allen Institute/Washington University(米国)
• [Journal Article] Whole-Body and Whole-Organ 3D Imaging of Hypoxia Using an Activatable Covalent Fluorescent Probe Compatible with Tissue Clearing (2024)
  • Author(s): Daichi M. Sakamoto; Iori Tamura; Bo Yi; Sho Hasegawa; Yutaro Saito; Naoki Yamada; Yoichi Takakusagi; Shimpei I. Kubota; Minoru Kobayashi; Hiroshi Harada; Kenjiro Hanaoka; Masayasu Taki; Masaomi Nangaku; Kazuki Tainaka; Shinsuke Sando
  • Journal Title: ACS Nano Volume: 18 Issue: 6 Pages: 5176-5179
  • DOI: 10.1021/acsnano.3c12716
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] High-precision rapid testing of omicron SARS-CoV-2 variants in clinical samples using AI-nanopore (2023)
  • Author(s): Murakami Kaoru、Kubota Shimpei I.、Tanaka Kumiko、Tanaka Hiroki、Akabane Keiichiroh、Suzuki Rigel、Shinohara Yuta、Takei Hiroyasu、Hashimoto Shigeru、Tanaka Yuki、Hojyo Shintaro、Sakamoto Osamu、Naono Norihiko、Takaai Takayui、（１０名省略）、Taniguchi Masateru、Murakami Masaaki
  • Journal Title: Lab on a Chip Volume: 23 Issue: 22 Pages: 4909-4918
  • DOI: 10.1039/d3lc00572k
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Computer model of IL-6-dependent rheumatoid arthritis in F759 mice (2023)
  • Author(s): Yamamoto Reiji、Yamada Satoshi、Atsumi Toru、Murakami Kaoru、Hashimoto Ari、Naito Seiichiro、Tanaka Yuki、Ohki Izuru、Shinohara Yuta、Iwasaki Norimasa、Yoshimura Akihiko、Jiang Jing-Jing、Kamimura Daisuke、Hojyo Shintaro、Kubota Shimpei I、Hashimoto Shigeru、Murakami Masaaki
  • Journal Title: International Immunology Volume: 35 Issue: 9 Pages: 403-421
  • DOI: 10.1093/intimm/dxad016
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In situ Microinflammation Detection Using Gold Nanoclusters and a Tissue-clearing Method (2023)
  • Author(s): Naim Fayrouz、Hasebe Rie、Hojyo Shintaro、Shichibu Yukatsu、Ishii Asuka、Tanaka Yuki、Tainaka Kazuki、Kubota Shimpei、Konishi Katsuaki、Murakami Masaaki
  • Journal Title: BIO-PROTOCOL Volume: 13 Issue: 7 Pages: 7-7
  • DOI: 10.21769/bioprotoc.4644
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Calcineurin inhibitor inhibits tolerance induction by suppressing terminal exhaustion of donor T cells after allo-HCT (2023)
  • Author(s): Senjo Hajime、Harada Shinpei、Kubota Shimpei I.、Tanaka Yuki、Tateno Takahiro、Zhang Zixuan、Okada Satomi、Chen Xuanzhong、Kikuchi Ryo、Miyashita Naoki、Onozawa Masahiro、Goto Hideki、Endo Tomoyuki、Hasegawa Yuta、Ohigashi Hiroyuki、Ara Takahide、Hasegawa Yoshinori、Murakami Masaaki、Teshima Takanori、Hashimoto Daigo
  • Journal Title: Blood Volume: 142 Issue: 5 Pages: 477-492
  • DOI: 10.1182/blood.2023019875
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] GM-CSF Promotes the Survival of Peripheral-Derived Myeloid Cells in the Central Nervous System for Pain-Induced Relapse of Neuroinflammation (2023)
  • Author(s): Matsuyama Shiina、Yamamoto Reiji、Murakami Kaoru、Takahashi Nobuhiko、Nishi Rieko、Ishii Asuka、Nio Kobayashi Junko、Abe Nobuya、Tanaka Kumiko、Jiang Jing Jing、Kawamoto Tadafumi、Iwanaga Toshihiko、Shinohara Yuta、（４名省略）、Kubota Shimpei I、（４名省略）、Murakami Masaaki
  • Journal Title: The Journal of Immunology Volume: 211 Issue: 1 Pages: 34-42
  • DOI: 10.4049/jimmunol.2200567
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Dupuytren's contracture-associated SNPs increase SFRP4 expression in nonimmune cells including fibroblasts to enhance inflammation development (2023)
  • Author(s): Kida H, Jiang JJ, Matsui Y, Takahashi I, Hasebe R, Kawamura D, Endo T, Shibayama H, Kondoh M, Nishio Y, Nishida K, Matsuno Y, Oikawa T, Kubota S, Hojyo S, Iwasaki N, Hashimoto S, Tanaka Y, Murakami M.
  • Journal Title: Int Immunol. Volume: dxad004 Issue: 7 Pages: 303-312
  • DOI: 10.1093/intimm/dxad004
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Zoobiquity experiments show the importance of the local MMP9-plasminogen axis in inflammatory bowel diseases in both dogs and patients. (2023)
  • Author(s): Takeshi Yamasaki, Noriyuki Nagata, Toru Atsumi, Rie Hasebe, Yuki Tanaka, Izuru Ohki, Shimpei Kubota, Yuta Shinohara, Yong Bin Teoh, Nozomu Yokoyama, Noboru Sasaki, Kensuke Nakamura, Hiroshi Ohta, Takehiko Katsurada, Yoshihiro Matsuno, Shintaro Hojyo, Shigeru Hashimoto, Mitsuyoshi Takiguchi, Masaaki Murakami.
  • Journal Title: International immunology Volume: - Issue: 7 Pages: 313-326
  • DOI: 10.1093/intimm/dxad006
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Combination therapy with bevacizumab and CCR2 inhibitor for women with ovarian cancer: in vivo validation study (2023)
  • Author(s): Tianyue Zhai, Takashi Mitamura, Lei Wang, Shimpei I Kubota, Masaaki Murakami, Shinya Tanaka, Hidemichi Watari
  • Journal Title: Cancer Medicine Volume: - Issue: 8 Pages: 9697-9708
  • DOI: 10.1002/cam4.5674
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A hybrid open-top light-sheet microscope for versatile multi-scale imaging of cleared tissues (2022)
  • Author(s): Glaser AK, Bishop KW, Barner LA, Susaki EA , Kubota SI, ..., Huang H, Reder NP, Wilson JJ, Sivakumar R, Shamskhou E, Stoltzfus CR, Wei X, Hempton AK, Pende M, Murawala P, Dodt HU, Imaizumi T, Shendure J, Beliveau BJ, Gerner MY, Xin L, Zhao H, Tru LD, Reid RC, Chandrashekar J, Ueda HR, Svoboda K, Liu JTC
  • Journal Title: Nature Methods Volume: 19 Issue: 5 Pages: 613-619
  • DOI: 10.1038/s41592-022-01468-5
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] An analysis modality for vascular structures combining tissue-clearing technology and topological data analysis (2022)
  • Author(s): Takahashi K, Abe K, Kubota SI, Fukatsu N, Morishita Y, Yoshimatsu Y, Satoshi Hirakawa, Yoshiaki Kubota, Tetsuro Watabe, Shogo Ehata, Hiroki R. Ueda, Teppei Shimamura, Kohei Miyazono
  • Journal Title: Nature Communiactions Volume: 13 Issue: 1 Pages: 5239-5239
  • DOI: 10.1038/s41467-022-32848-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 組織透明化技術を用いた三次元空間解析 (2023)
  • Author(s): 久保田晋平
  • Organizer: 第一回北海道バイオ"Mix-up"
• [Presentation] 組織透明化技術を用いた全細胞解析 (2023)
  • Author(s): 久保田晋平
  • Organizer: 量子生命科学先端フォーラム2023 夏の研究会
• [Presentation] がん組織不均一性に資する全身全細胞解析技術の構築 (2022)
  • Author(s): 久保田晋平, 高橋恵生, 西田純, 江幡正悟, 田井中一貴, 上田泰己, 宮園浩平
  • Organizer: 第111回日本病理学会総会
• [Presentation] 組織透明化による一細胞解像度での病理学解析 (2022)
  • Author(s): 久保田晋平
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会
• [Presentation] 光シート顕微鏡を用いた三次元病理学解析 (2022)
  • Author(s): 久保田晋平、村上正晃
  • Organizer: 光シート顕微鏡ワークショップ
  • Invited
• [Presentation] 組織透明化技術を基盤とした三次元病理学解析 (2022)
  • Author(s): 久保田晋平
  • Organizer: iSeminar
  • Invited
• [Presentation] ゲートウェイ反射による 組織特異的な炎症性疾患の誘導機構 (2022)
  • Author(s): 久保田晋平、長谷部理絵、村上薫、田中勇希、村上正晃
  • Organizer: 第102回 北海道医学大会 病理分科会
• [Presentation] 組織透明化を用いたがん微小環境の全細胞解析 (2022)
  • Author(s): 久保田晋平
  • Organizer: 遺伝子・デリバリー研究会第21回シンポジウム
  • Invited
• [Remarks] 【分野横断で描く未来#7】簡便・迅速なウイルス人工合成技術で迎え撃つ未来のウイルス感染症
  • URL: https://www.hokudai.ac.jp/researchtimes/2023/05/7-1.html
• [Remarks] 移植⽚対宿主病の新たな発症機序を解明
  • URL: https://www.hokudai.ac.jp/news/pdf/230804_pr2.pdf
• [Remarks] AI ナノポアにより変異型新型コロナウイルスを 高感度・高特異度に検査
  • URL: https://www.hokudai.ac.jp/news/pdf/231026_pr2.pdf