細菌病原性発現を制御する「微細なpH応答機構」の解明

Research Project

Project/Area Number	22K15462
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 49050:Bacteriology-related
Research Institution	The Nippon Dental University
Principal Investigator	山中幸日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (00760240)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000) Fiscal Year 2025: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000) Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Keywords	酸性 / pH / 腸球菌 / 常在菌 / 膜タンパク質 / HdeD / LysR / Enterococcus faecalis / 細菌 / 病原性 / プロトン
Outline of Research at the Start	申請者はこれまでに大腸菌をモデルとして、中性付近の10倍以下のプロトン量変化に応答する膜タンパク質を発見した。本研究では、細菌のpH適応性と病原性発現の理解に向けて「微細なpH応答機構とシステムの普遍性」を解明する。結果として、細菌が大幅なpH変化だけでなく微細なプロトン量変化を感知し、細胞エネルギーの獲得と病原性発現に還元する過程が明らかになる。将来的に、細菌のpH適応性を利用した病原性を発揮させないための予防剤開発に応用展開できる。
Outline of Annual Research Achievements	微細なpH変化を感知すると予想される膜タンパク質の結晶構造解析では、リコンビナントタンパク質の精製を行った。昨年度までに検討した「Hisタグで精製可能な大腸菌膜タンパク質を発現するプラスミド」および「大腸菌内での安定的発現を可能にする培養条件」を用いて大量培養を行い、目的タンパク質を発現した大腸菌を得た。その後、膜画分から目的の膜タンパク質を抽出するための界面活性剤およびその処理方法の検討を行った。この結果、n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM)で可溶化に成功した。ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製後、電気泳動後に切り出したゲルバンドをトリプシン処理し、質量分析によって目的の膜タンパク質であることを確認した。オーソログ遺伝子の同定では、①レポーター遺伝子発現、②溶血活性測定、③バイオフィルム形成測定を利用して、ヒト口腔から単離された腸球菌ゲノムに対してスクリーニングを行った。①では、昨年度までに全塩基配列を解読した腸球菌ゲノムの性状を解析し、病原性関連遺伝子群を同定し、さらに新規プラスミドの存在を確認した。この内在性プラスミドを利用して、同定された病原性遺伝子群および昨年度までに同定していた転写因子のプロモーター領域に対し、レポーター遺伝子を構築した。また、腸球菌から内在性プラスミドを除去し、このプラスミド除去株を用いて染色体上の突然変異株ライブラリーを作製した。その後、①から③の実験系より、スクリーニング解析を実施し、腸球菌ゲノム上のオーソログ遺伝子候補を強く支持する結果を得ている。これらの方法を用いることで、コンピューターによる相同性予測から検出できなかった大腸菌遺伝子のオーソログをヒト常在菌ゲノムから取得可能なことが実証できた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 結晶構造解析に向けて、膜画分に発現したHisタグ融合タンパク質を精製することができた。質量分析によって目的の膜タンパク質であることも確認できた。しかし、ニッケル含有のアフィニティークロマトグラフィーのみでは、高純度の精製ができないことが判明し、さらに収量も十分ではないため、現在も、より高濃度のタンパク質を取得するために実験は継続している。この部分は当初計画よりも若干遅れ気味であるため、令和６年度の早期に終了できるように進めている所である。「微細なpH変化の伝達機構の普遍性」を理解する上で重要な、オーソログ遺伝子の機能的探索法を確立した。この手法を用いて、幅広い細菌種のゲノムに対し目的のオーソログ遺伝子を検出可能である可能性を示す事ができた。腸球菌ゲノムから単離したオーソログ候補遺伝子は、膜タンパク質をコードしており、大腸菌で予想された「微細なpH変化を感知する膜タンパク質」に高い相同性を示す一次構造領域が確認された。一方で、類似領域は部分的であり、当初予定していた通り大規模なコンピューター配列予測からは見落とされていた。細菌分類から比較的に遠縁種である腸球菌染色体上に大腸菌オーソログ遺伝子が検出されたことは、予想している仕組みが細菌に普遍的に存在することを裏付ける結果と捉えることができる。また、内在性プラスミドをベクターとしてレポータープラスミドを改良することでより安定的なレポーター発現を実現することにも成功した。この点は当初は想定していなかった結果と言えるが、レポーター遺伝子を用いたスクリーニング解析を実施する上で有用なツールとなった。以上を踏まえて、順調に進捗していると言える。
Strategy for Future Research Activity	結晶構造関連の課題については、引き続き、タンパク質精製の改善を図る。高純度のタンパク質を得るため、アフィニティークロマトグラフィー後にイオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィーを実施する予定である。また、全体の培養量を検討することで、収量を増やしていく。十分なタンパク質量が得られた時点で、これを結晶化し、構造解析へ進める。結晶が得られない場合は、核磁気共鳴(NMR)解析を行うことを予定している。標的の膜タンパク質は、190アミノ酸 (分子量20.9 kDa)から成り、比較的小さいためNMRによる全長の構造解析が可能であると予想される。標的の膜タンパク質とプロトンの相互作用については、令和７年度末の研究期間終了までに、様々なpH溶液での構造を検出すると共に、そのプロトン感受性について考察できる結果を得る必要がある。オーソログ遺伝子の同定については、昨年までの解析を継続し、ヒト口腔由来の他の常在菌に対してスクリーニングを目指す。既に口腔から分離されたEnterococcus faeciumやStaphylococcus aureusを対象に実施し、微細pH変化の感知伝達機構の幅広い普遍性を考察する。オーソログ遺伝子の細菌病原性発現制御への影響については、腸球菌ゲノム上の候補遺伝子を相同組換え法により欠失し、野生株と欠失株で病原性発現の比較を行う。病原性として①バイオフィルム形成、②毒素分泌、③繊毛を介した付着性を調べる。バイオフィルム形成は、昨年度までの手法を継続し、クリスタルバイオレッド法により野生株と欠失株で比較する。毒素分泌は、ヒト血液を用いて野生株と欠失株で溶血性を比較する。繊毛形成は、細胞表層を電子顕微鏡で観察し、違いを確認する。これらの結果をまとめ、微細pH変化の感知伝達機構が細菌病原性発現制御に普遍的に関与しているのかを考察していく。