グラム陰性菌外膜タンパク質の膜挿入機構の解明

Research Project

Project/Area Number	22K15463
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 49050:Bacteriology-related
Research Institution	University of Miyazaki (2023) Soka University (2022)
Principal Investigator	青木英莉子宮崎大学, フロンティア科学総合研究センター, 研究員 (80822874)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000) Fiscal Year 2025: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000) Fiscal Year 2024: ¥260,000 (Direct Cost: ¥200,000、Indirect Cost: ¥60,000) Fiscal Year 2023: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000) Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Keywords	BAM複合体 / βバレル / 大腸菌 / オートトランスポーター / グラム陰性菌 / 外膜タンパク質 / OMP
Outline of Research at the Start	グラム陰性菌の外膜に存在する様々なタンパク質は、栄養物質の取り込みや老廃物の排出等の役割を担っており、細菌の生存にとって重要である。また、これらのタンパク質には、細菌が感染する際に感染相手に結合する役割を持つものや毒物を放出する役割を持つものも存在する。このような外膜タンパク質が正しく機能するには、BAM複合体と呼ばれる外膜タンパク質の構造形成を補助する複合体が必要である。このBAM複合体は複数のタンパク質が集まって機能しているが、それぞれの役割は未だ不明である。本研究では、これらのタンパク質がどのような役割を担っているかを明らかにすることを目指す。
Outline of Annual Research Achievements	大腸菌の外膜に存在するBAM複合体は外膜タンパク質であるBamAと４つのリポタンパク質（BamB、BamC、BamD、BamE）で構成される。昨年度はBamB-Eの機能を調べるために、主要構成要素であるBamAとBamB-Eのいずれか１つのタンパク質で構成される複合体の再構成を試みた。しかしながら、複合体の再構成に想定より時間がかかっている為、今年度はBamB-Eのうち１つの遺伝子が欠損した大腸菌からBAM複合体を含む膜画分を分離し、これを使用して基質タンパク質の１つであるインフルエンザ菌由来アドへシン（Hia）の膜挿入を観察した。しかしながら、完全なBAM複合体とBamB-Eのいずれかがが欠損したBAM複合体ではHiaの膜挿入に違いが見られなかった。そのため、BamB-Eの役割を新たな視点から観察するために、ピロリ菌のBAM複合体と基質を使用した実験を行った。ピロリ菌BAM複合体は、大腸菌のBAM複合体と異なり細菌の生存に必須であるとされているBamAとBamDのみで構成されている。そこでピロリ菌BAM複合体と大腸菌BAM複合体の反応を比較することによって構成要素の違いによる影響を明らかにすることにした。そして、ピロリ菌BAM複合体を使用した基質タンパク質の膜挿入反応の観察方法の確立を試みた。最初に基質とするピロリ菌外膜タンパク質のクローニングを行い、無細胞合成系で発現させた。この合成した基質とピロリ菌BAM複合体を含む膜画分を使用して膜挿入反応を観察した。その結果、ピロリ菌BAM複合体による基質タンパク質の膜挿入反応に由来すると考えられる現象の観察に成功した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初の予定では、一部のタンパク質を欠損させたBAM複合体を用いてインフルエンザ菌由来アドへシンの膜挿入反応への影響を観察してBAM複合体リポタンパク質の役割を調査する予定であった。しかし、完全なBAM複合体と１つのリポタンパク質が欠損したBAM複合体では膜挿入反応に違いが観察されなかった。それにより当初の実験計画の遅れが生じ、計画の一部を変更する必要が生じた。このため当初の実験計画にない大腸菌と異なる構成のBAM複合体を持つピロリ菌を使用して基質タンパク質の膜挿入反応を観察した。最初にピロリ菌BAM複合体による基質タンパク質の膜挿入反応の追跡方法の確立を試みた。ピロリ菌BAM複合体による基質タンパク質の膜挿入機構は大腸菌と比較して研究が進んでいないため、未知の要素が多数あったが基質タンパク質の膜挿入反応の観察に成功した。この成功により、ある程度遅れを取り戻したと考えられる。そのため、やや遅れているとした。
Strategy for Future Research Activity	ピロリ菌BAM複合体を使用した基質タンパク質の膜挿入反応の観察に成功した。今後は、ピロリ菌と大腸菌におけるBAM複合の構成要素数の違いが与える膜挿入反応の違いを明らかにする。また、ピロリ菌と大腸菌の基質リストの比較からBAMの構成要素の違いが基質の多様性や特徴に影響を及ぼしているかを調査する。