• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to previous page

蚊組織におけるフラビウイルスの糖鎖修飾部位に対する選択メカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number 22K15477
Research Category

Grant-in-Aid for Early-Career Scientists

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section Basic Section 49060:Virology-related
Research InstitutionRakuno Gakuen University

Principal Investigator

内田 玲麻  酪農学園大学, 獣医学群, 准教授 (50756723)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Keywords蚊媒介性フラビウイルス / エンベロープ / 糖鎖修飾 / Quasispecies / 選択 / 蚊由来株化細胞 / 不死化 / フラビウイルス / 蚊 / 組織特異的選択
Outline of Research at the Start

蚊媒介性フラビウイルスのエンベロープタンパクにおける糖鎖修飾は、宿主細胞への吸着やベクター媒介能、脊椎動物の病原性に影響を与える因子として重要である。本研究では、蚊体内で遺伝子学的に多様な状態(Quasispecies)で存在するフラビウイルスが、エンベロープの糖鎖修飾部位について、どのようなメカニズムで特定の遺伝子型が選択されていくかを明らかとする。そのために、デングウイルスおよびジカウイルスの感染性クローンを作成し、複数の遺伝子型を混ぜた状態で蚊組織特異的培養細胞に感染させ、どの遺伝子型が選択されていくかを明らかにすると共に、その選択に関わる細胞因子を種々の手法により同定する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目標は蚊体内で遺伝子学的に多様な状態(Quasispecies)で存在するフラビウイルスが、エンベロープの糖鎖修飾部位について、どのようなメカニズムで特定の遺伝子型が選択されていくか明らかにすることである。そのため、2023年度は1.ジカウイルスのVirus-like particles(VLPs)および感染性クローンの確立と2. cMYC遺伝子を用いたヤマトヤブカ初代培養細胞の不死化を進めた。
1.  ジカウイルスのVirus-like particles(VLPs)および感染性クローンの確立
2022年度まで、糖鎖修飾部位に変異やFLAGタグを加えたジカウイルスのVirus-like particles(VLPs)を発現するプラスミドを用い、哺乳類細胞でVLPsの作成を試みたが、上手くいっていなかった。2023年度はトランスフェクション試薬やウエスタンブロッティングの条件を見直し、糖鎖修飾型および非糖鎖修飾型のジカウイルスVLPsを哺乳類細胞で発現させることに成功した。また、プロモーター、pA配列等を昆虫細胞発現用に変えたプラスミドを構築し、現在、蚊由来細胞でVLPsの作成を試みている。
2.  cMYC遺伝子を用いたヤマトヤブカ初代培養細胞の不死化
2022年度に作成した昆虫細胞用cMYC発現プラスミドを用い、北海道江別市近郊で捕獲したヤマトヤブカから分離した細胞に対し、不死化を試みた。しかし、細胞培養の過程で多くの細菌、真菌汚染が確認され、最終的に株化細胞を得るに至らなかった。また2022年度までの結果ではCMVプロモーター下での目的遺伝子の発現が極めて低かったことから、これまでの方針を変更し、現在はヒトの癌抑制遺伝子(p53)の相同遺伝子(p53-1および2)をノックダウン、ノックアウトする方向で進めている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2023年度末時点では1. 感染性クローンが確立され、2. 蚊由来初代培養細胞の不死化についてある程度の目途が立てられている状況であったが、残念ながらいずれの結果も得られていない。要因として昆虫由来細胞に対する遺伝子導入手法およびウエスタンブロッティングの条件検討に予想以上に多くの時間を費やしたことが挙げられる。現在、後者については安定した手法を得られたため、これまでの遅れを挽回できると考える。

Strategy for Future Research Activity

本研究の最終目標は蚊体内でフラビウイルスが、エンベロープの糖鎖修飾部位について、どのようなメカニズムで特定の遺伝子型が選択されていくか明らかにすることであり、そのために2024年度は1. 感染性クローンの構築と2. p53-1、2遺伝子ノックダウン、ノックアウトによる蚊初代培養細胞の株化を試みる。1については2023年度に作成したCPER用の全長cDNAを用い、糖鎖修飾型および非修飾型のジカウイルス感染性クローンを作製する。また、2については、現在、ヒトスジシマカ由来C6/36細胞のp53-1、2遺伝子配列を明らかにしている段階であり、RACE PCRにより明らかにしたmRNAに対し、CRISPR-Cas9によるp53-1、2遺伝子ノックアウトの系を作成する。

Report

(2 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • Research Products

    (8 results)

All 2023 2022 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (1 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 1 results,  Open Access: 1 results) Presentation (5 results)

  • [Int'l Joint Research] IRD/IGF(フランス)

    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Int'l Joint Research] IRD/MiVEGEC(フランス)

    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Journal Article] Identification of Three Novel Genes in <i>Phenuiviridae</i> Detected from <i>Aedes</i> Mosquitoes in Hokkaido, Japan2023

    • Author(s)
      Uchida Leo、Sakurai Yoshimi、Shimooka Makoto、Morales-Vargas Ronald Enrique、Hagiwara Katsuro、Muramatsu Yasukazu
    • Journal Title

      Japanese Journal of Infectious Diseases

      Volume: 76 Issue: 1 Pages: 55-63

    • DOI

      10.7883/yoken.JJID.2022.179

    • ISSN
      1344-6304, 1884-2836
    • Year and Date
      2023-01-31
    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] 北海道産ミスジシマカより分離された 新規蚊特異的フラビウイルス2023

    • Author(s)
      内田玲麻、櫻井愛美、富久藍、村松康和
    • Organizer
      第29回トガ・フラビ・ペスチウイルス研究会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 北海道産ヤブカ属の蚊における 蚊特異的ウイルスの検出2023

    • Author(s)
      内田玲麻、櫻井愛美、富久藍、村松康和
    • Organizer
      第166回日本獣医学会学術集会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 3種のヤブカ体内において選択されたジカウイルスのゲノム変異評価2022

    • Author(s)
      下岡誠, 三木要, 江下優樹, 大場靖子, 澤洋文, 村松康和, 内田玲麻
    • Organizer
      第165回日本獣医学会学術集会 公衆衛生分科会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] 北海道産ヤブカ属蚊における蚊特異的フラビウイルス科、フェニュイウイルス科ウイルスの検出2022

    • Author(s)
      内田玲麻, 櫻井愛美, 下岡誠、Ronald, Enrique Morales-Vargas, 萩原克郎, 村松康和
    • Organizer
      第28回トガ・フラビ・ペスチウイルス研究会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] 北海道産ヤブカ属の蚊におけるジカウイルス感受性評価2022

    • Author(s)
      内田玲麻, 川江詩乃, 下岡誠, 江下優樹, 大場靖子, 澤洋文, 村松康和
    • Organizer
      第69回日本ウイルス学会学術集会
    • Related Report
      2022 Research-status Report

URL: 

Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi