Polled In Vivo CRISPR-Cas9 Screening in iPSCs to generate immune-evasive iPSCs

• Project/Area Number: 22K15490
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 49070:Immunology-related
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 王 博 京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点助教 (80842765)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: iPS細胞 / NK細胞 / CRISPR-Cas9 / スクリーニングライブラリ / 免疫シナプス / HLA / iPSC / immune rejection / CRISPR Screening

Outline of Research at the Start

Polled CRISPR-Cas9 Screening in iPSCs would contribute to explore new factors to generate allogenic transplantable iPSCs derivates to broaden the clinical use of iPSCs.

Outline of Annual Research Achievements

この研究は、iPS細胞由来の細胞製品の移植可能性に関する免疫原性の問題に焦点を当てています。具体的には、in vivoでの免疫反応を制御する遺伝子を特定することを目指して、ゲノムワイドな遺伝子スクリーニングを行い、免疫反応に対する耐性を持つ遺伝子を探索しています。まず、MHC dKOヒトiPS細胞を用いて、NK細胞による殺傷圧力下でのスクリーニングを行う方針を決定しました。次に、臨床グレードのiPSCからB2M/CIITA dKO iPS細胞を作製し、その細胞とNK細胞を共培養して、NK細胞によるdKO iPS細胞のキリング条件を探索しました。さらに、Lenti-virusを用いたHuman CRISPR-Cas9スクリーニングライブラリをdKO iPS細胞に導入し、一個細胞に平均的に1種類のgRNAを導入する条件を探索しました。大量のiPS細胞培養中に、gRNAの発現量が不安定な問題が発生しており、現在この課題の克服策を模索中です。
また、Cell lineを用いたゲノムワイドな遺伝子スクリーニング研究を参考にし、同定した重要な免疫シナプス形成に関わる分子であるCD54、CD58、CD48のゲノム編集iPS細胞も作製しました。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

スクリーニング実験に必要な10^8以上のiPS細胞を増殖させる際に、gRNAの発現が不安定になることがあったため。

Strategy for Future Research Activity

ベクターの薬剤耐性を利用し、培養中に適切な時期で薬剤を選択して、安定なgRNAの発現を確保し、大量のiPS細胞を獲得します。
免疫シナプス形成に関わる分子であるCD54、CD58、CD48のゲノム編集iPS細胞を造血幹細胞様細胞に分化させ、それらをさらにT細胞に分化させます。そして、NK細胞の免疫回避能を調査します。同時に、分化した細胞の機能も詳細に研究します。