| Project/Area Number |
22K15525
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 50010:Tumor biology-related
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
高梨 裕典 浜松医科大学, 医学部附属病院, 助教 (50898872)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | 肺癌 / 癌関連繊維芽細胞 / UBL3 / エクソソーム / 乳癌 / がん関連線維芽細胞 / 細胞外小胞 |
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| Outline of Research at the Start |
肺癌をはじめとする癌細胞は癌関連繊維芽細胞（CAF）を誘導する。CAFはエクソソームなどの液性因子を介して癌細胞の生存・増殖・浸潤を促進する。近年、UBL3がエクソソームへ癌の増殖・浸潤に関わるタンパク質取り込みを担うことが解明された。本研究はCAFに発現するUBL3がエクソソームへ治療ターゲットとなり得るタンパク質取り込みを介して癌病勢進行に関与しているか検証し、新規治療ターゲットを探索する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
CRISPR/CAS9により樹立したUBL3ノックアウト肺腺癌細胞株(A549)の培養上清より超遠心法でエクソソームを抽出した。CD63をはじめとする複数のエクソソームマーカーが、抽出したエクソソームにおいて発現している事をウエスタンブロットで確認した。エクソソームにおけるUBL3発現は、従来用いていたウエスタンブロットでは確認が出来なかったが、高感度ECL等を用いてプロトコールを改変する事でUBL3発現を確認することが出来た。既報では乳癌細胞のエクソソームにUBL3がタンパク質を積載しており、UBL3はエクソソームに留まる事が知られていた。今回の実験で、肺癌細胞においても乳癌と同様にエクソソームへUBL3が局在することがわかったため、UBL3が肺癌細胞のエクソソームにおいてもタンパク質の積載を担っていることが示唆された。
癌細胞単独で増殖アッセイ(Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo))、遊走アッセイ(trans-well insert (Corning))、浸潤アッセイ(Matrigel invasion chamber (Corning))をそれぞれ行った。UBL3ノックアウト株では親株に比して、増殖能は約1.3倍、浸潤能は約1.6倍、遊走能は約6倍促進されていることが確認され、癌細胞単独においてはUBL3が癌進展の抑制因子として作用していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
エクソソームにおけるUBL3発現をウエスタンブロットで確認することが従来のプロトコールでは困難であり、条件検討に時間を要した。
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| Strategy for Future Research Activity |
UBL3の局在が確認されたエクソソームにおいてプロテオミクス解析を行い、ノックアウト株と親株においてエクソソームに内包されるタンパク質の差異について解析する。
樹立したCAFと腫瘍細胞を併用して増殖、浸潤、遊走アッセイを行い、UBL3のCAFに対する作用を検証する。
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