| Project/Area Number |
22K15573
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 50020:Tumor diagnostics and therapeutics-related
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| Research Institution | National Hospital Organization Nagoya Medical Center |
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Principal Investigator |
飯島 友加 独立行政法人国立病院機構(名古屋医療センター臨床研究センター), その他部局等, 流動研究員 (40726923)
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| Project Period (FY) |
2023-01-20 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | 小児急性リンパ性白血病 / 微小残存病変 / ゲノム構造異常 / 白血病 / Ig/TCR遺伝子再構成 / ロングリードシーケンス |
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| Outline of Research at the Start |
小児急性リンパ性白血病の治療において、微小残存病変（Minimal residual disease ; MRD)の測定は予後予測や治療選択において重要な要素である。日本では主にイムノグロブリン(Ig)とT細胞受容体(TCR)という遺伝子の配列が患者特異的なマーカーとしてMRD測定に用いられているが、約10％の症例では特異的なマーカーが得られず、MRD測定が出来ない。そこで本研究では、マーカーが得られない理由を調べるために、ロングリードシーケンス法を用いて、Ig/TCR遺伝子の配列を詳細に解析する。また、マーカーが得られない症例の特徴について既存のデータと合わせて解析を行う予定である。
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| Outline of Annual Research Achievements |
BCP-ALLとT-ALLにおいて、クローナルなIg/TCR再構成が検出されない症例と、BCP-ALL症例におけるIgH再構成未検出かつIgKもしくはIgL遺伝子再構成が検出される（IgH(-)）症例の選定を目的として、以前に行ったshort read sequencingのデータを使用した ① vidjilによるIg/TCR再構成クローンの同定、② Genomonによる欠失や転座、逆位といったようなゲノムの構造異常、③ シーケンス深度(depth)から推測される欠失などの構造異常について解析を行った。①の解析から、BCP-ALLでは、760例中22例（約3％）で、いずれのIg/TCR遺伝子再構成も検出されず、１例を除きゲノムの構造異常は検出されなかった。また、IgH(-)症例は29例（約4％）で、IgH遺伝子領域に欠失や逆位、転座などの多くの構造異常が検出されたが、一意的にIgH再構成が検出できない原因を特定することは困難であった。一方、両アリルにIgH領域の欠失が確認された領域についてRQ-PCRを行い、IgH以外の再構成をターゲットとした微少残存病変（MRD）の値と比較したところ良く相関しており、IgHの欠失がMRDのターゲットとして機能する可能性が示唆された。T-ALLでは105例中36例（34％）でIg/TCR遺伝子再構成は検出されず、欠失などのゲノムの構造異常も検出されなかった。
Long read capture sequenceの準備として、ニードルと超音波のよるDNA断片化を検討した。ニードルでは20-25kbの揃った長さに断片化可能であったが、それ以上短くすることは困難であった。一方超音波を使用した場合には、ブロードではあるが、数キロから数十キロをピークとした断片化が可能であり、こちらを採用することとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究を計画した当初は、capture法によるlong read sequencingの手法は確立されておらず、当研究室で行っていた予備実験でも、1-3kbに断片化したDNAから～1kbのリードが得られる程度であったため、全ゲノムのlong read sequencingとの併用を考えており、まずこちらを実行するつもりであった、しかし、R5年の夏から秋にかけて、複数の試薬会社からcapture法によるlong read sequencingの手法について提案を頂き、検討・準備に対し時間を要したため、long read sequencingの実施が少し遅れている。R5年度末において、試薬等の準備が整ったため、R6年度に順次シーケンスを行う予定である。全ゲノムのlong read sequencingについては、capture法の結果を見て必要性を判断することとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、現在準備を進めているONT社のnanoporeシーケンサーを用いた、target capture long read sequencingを進めていく。具体的には、まず単一クローンである細胞株を用いてプローブによるキャプチャー法を用いたtarget capture long read sequencingとその後の専用のソフトウェアを使った解析がワークするかの確認を行い、実際の臨床検体を用いて解析を進めていく。対象症例は、昨年度に行ったshort read sequencingの解析で、従来のIg/TCR遺伝子再構成は検出されないものの、何らかのゲノム異常が示唆された症例を中心に８例ほどを予定している。また、特にIgH領域には個人特有の欠失などが含まれることがR５年度の解析からも懸念されるため、寛解期の検体をコントロールとして用いて解析を行う予定である。
また、昨年度のshort read sequencingの解析により、クローナルなIg/TCR遺伝子再構成が検出されない症例について、臨床情報やRNA sequencing、細胞表面マーカーなどの情報の収集を行う。また、検出された構造異常のMRDとしての有用性などを引き続き検証する。
最終年度においては、short readとlong readのシーケンス結果の統合と必要な多検体での解析を予定しており、臨床情報も併せてIg/TCR領域におけるゲノム異常について得られた知見をまとめる。
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