| Project/Area Number |
22K15694
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 52010:General internal medicine-related
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
堀内 優奈 順天堂大学, 医療科学部, 助教 (20912900)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | てんかん / DEPDC5 / iPS細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
てんかんは人口の約1-3%に発症し、発作時の自動車事故、転倒転落による外傷や突然死など、患者のみならず社会全体の問題となっている。イオンチャネルや神経伝達物質受容体を対象とする薬剤が主に治療に用いられるが、約30％の患者は薬剤抵抗性を示す。近年、新しく検出された成人性難治性てんかんの関連遺伝子にDEPDC5が挙げられる。DEPDC5は、イオンチャネルや受容体とは全く異なる因子であり、その病因メカニズムが不明なため薬剤の選択に難渋する。そこで、DEPDC5遺伝子変異を導入したヒトiPS由来神経細胞モデルを作成し、そのメカニズムを解明・検証し、最終的に難治性てんかん治療薬の開発に貢献したい。
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| Outline of Annual Research Achievements |
DEPDC5は近年新しく検出された成人性薬剤抵抗性てんかんの関連遺伝子である。DEPDC5は従来てんかん遺伝子として知られてきたイオンチャネルや神経伝達物質受容体とは全く異なる因子であり、その病因メカニズムが不明なため薬剤の選択に難渋する。そこで、本研究ではDEPDC5遺伝子変異を導入したヒトiPS由来神経細胞モデルを作成し、そのてんかん発症メカニズムを解明・検証することを目的とした。
本研究においては、てんかん患者で検出されたDEPDC5遺伝子変異および臨床データの集積を行い、てんかんの分類や予後(再発の有無と程度)、脳波 (パターンと起源等)との関連について引き続き解析を進めている。また、CRISPR-Cas9法を用いて作製したDEPDC5ノックアウトヒトiPS細胞(heterologous)を神経細胞へと分化させ、カルシウムイメージング法にて機能評価を行ったところ、通常のヒトiPS細胞とは異なるパターンおよび頻度の自発発火が観察された。
今後はRNAシーケンスを用いて遺伝子発現解析を行うほか、パッチクランプ法などを用いて引き続き機能評価を行う。また、DEPDC5変異がどのような経路やタンパク質を介して細胞異常興奮を引き起こすのか、機序解明につながる経路の同定をWestern Blot法や免疫染色等を用いて目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初予定していた研究計画においては、(A)臨床データの集積と解析を2022年度-2023年度に、(B)ゲノム編集によるDEPDC5ノックアウト細胞作製と遺伝子発現解析を2022年度-2023年度に、(C)DEPDC5ノックアウト細胞における機能解析を2022年度-2024年度に行う予定であった。
(A)臨床データの集積と解析については、臨床データの集積を行い、てんかんの分類や予後、脳波との関連について一部解析を未だ継続して進めており、やや遅れている。
(B)ゲノム編集によるDEPDC5ノックアウト細胞作製と遺伝子発現解析については、ゲノム編集によるDEPDC5ノックアウト細胞を作製したが、遺伝子発現解析は進めている最中である。やや遅れていると言える。
(C)DEPDC5ノックアウト細胞における機能解析は、(B)で作製したDEPDC5ノックアウト細胞を神経細胞に分化させ機能評価をすでに行っており、おおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初予定していた研究計画においては、(A)臨床データの集積と解析を2022年度-2023年度に、(B)ゲノム編集によるDEPDC5ノックアウト細胞作製と遺伝子発現解析を2022年度-2023年度に、(C)DEPDC5ノックアウト細胞における機能解析を2022年度-2024年度に行う予定である。
(A)臨床データの集積と解析については、2023年度に引き続き臨床データの集積を行い、てんかんの分類や予後、脳波との関連について一部解析を進めていく。
(B)ゲノム編集によるDEPDC5ノックアウト細胞作製と遺伝子発現解析については、ゲノム編集によるDEPDC5ノックアウト細胞の作製が2022年度に終了、2023年度にはDEPDC5ノックアウト細胞を神経細胞に分化させ、RNAシーケンスによる遺伝子発現解析を開始しており、2024年度には引き続き遺伝子発現解析を進めていく。
(C)DEPDC5ノックアウト細胞における機能解析は、2023年度に(B)で作製したDEPDC5ノックアウト細胞を神経細胞に分化させ、カルシウムイメージング法での機能評価を行った。引き続き2024年度は、パッチクランプ法を用いて機能評価を行うほか、DEPDC5変異がどのようにして細胞異常興奮を引き起こすのか、機序解明につながる経路の同定をWestern Blotや免疫染色等を用いて行う。
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