血友病A治療における高機能型第FVIII因子製剤の開発
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22K15928
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
中島 由翔 奈良県立医科大学, 医学部附属病院, 研究員 (00905408)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | 高機能型FVIII / 血友病A / 高機能型第VIII因子 / 遺伝子治療 |
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| Outline of Research at the Start |
現在、血友病Aの遺伝子治療の開発は進んでおり、海外では様々なアプローチを用いて高機能型第VIII因子(FVIII)を作成する報告が散見されるが、その機能は野生株のFVIIIの約2倍程度であり、臨床応用には不十分であるのが現実である。また、FVIIIの活性化・不活化機序や各凝固因子との相互作用からアプローチしている報告はほとんどない。FVIIIの活性化を亢進するとともに、他の凝固因子との相互作用を高める変異およびFVIIIの不活化を抑制する変異を組み合わせることで、5-10倍の高機能型FVIIIの作成を行い、高活性型FVIII製剤の開発や血友病Aの遺伝子治療への臨床応用を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
BHK細胞によるFVIII発現系を用いて変異FVIII（K1813A, K1818A, K1813A/K1818A）を作成し、変異FVIIIの比活性を測定したところ、K1813AがWild type (WT) FVIIIの約2倍の比活性を認めた。それぞれのFVIII変異体（10 nM）にトロンビン（0.4 nM）を添加し、トロンビン添加後のFVIII活性を凝固一段法で経時的に測定したところ、K1813Aにおけるトロンビン活性化後の不活化はWTより約2倍抑制されていた(K1813AとWTの減衰係数(k )はそれぞれ1.8×10-2,3.5×10-2)。次に、FVIII変異体（1nM）にトロンビン（30 nM）を添加し、FVIII活性の不活化速度を凝固一段法で経時的に測定したところ、K1813Aにおけるトロンビン活性化後の不活化はWTより約2.4倍抑制されていた(k =2.9×10-2,7.0×10-2)。これらの結果より、K1813AはWTよりA2解離速度が抑制されることが示された。
K1813Aの包括的凝固能についてWTと比較検討したところ、トロンビン生成試験及びROTEMにおいて、WT 1nMとK1813A 0.5nMがほぼ同等の凝固能を示すことがわかり、K1813AはWTより2倍程度の凝固能を有することが示された。K1813AとWTをF8-Knock out (KO)マウスに投与し、凝血学的効果について尾端切断後出血量を用いて評価したところ、K1813A 2μg/kg投与時の出血量は、WT 2-4μg/kg投与時に比べて優位に低く、K1813A 1μg/kg投与時の出血量と、WT 2-4μg/kg投与時の出血量が同等であることがわかった。以上の結果から、K1813AはWTより約2-4倍程度の凝固能を有することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、K1813AがA2解離速度を抑制することでWTの約2倍高い凝固能を有する高機能型FVIIIであることをin vitro実験系で明らかにし、またK1813Aがin vivoにおいてもWTより約2-4倍の凝固能を有することを示した。その成果について、2022年にオンラインでBlood Advances誌に掲載された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、高機能型FVIII変異体作成のプランとして、FIXaとの親和性が亢進するK1813Aの変異を基にさらに①A2ドメイン解離によるFVIIIの不活化を抑制する変異、②プロテインSや活性化プロテインCによる不活化を抑制する変異（Takeyama et al., Br J Haematol, 2008, Takeyama et al. Thromb Haemost. 2013）、③トロンビンによるFVIII活性化を増強する変異（Nakajima et al. J Thromb Haemost. 2021）、④FXとの親和性を亢進する変異などを加えることで、比活性がWTの5-10倍のFVIII変異体の作成を目指す。
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Report
(1 results)
Research Products
(3 results)
