Project/Area Number |
22K15944
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Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Review Section |
Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
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Research Institution | Yamaguchi University |
Principal Investigator |
市村 卓也 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (10761900)
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Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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Keywords | 急性リンパ性白血病 / 6-メルカプトプリン / NUDT15 / 遺伝子多型 / デジタルPCR |
Outline of Research at the Start |
急性リンパ性白血病 (ALL) の治療に用いられる6-メルカプトプリン (6-MP) は、NUDT15 遺伝子の多型を有する症例で重度の骨髄抑制を生じる。特に複数の異なるNUDT15 多型を両アレルに有する複合へテロ接合性多型の症例では、極めて重度の骨髄抑制によって長期間の化学療法中断を余儀なくされ、治療成績の低下に関与している可能性がある。しかしながら、複合へテロ接合性多型を証明するディプロタイプ解析の方法は確立していない。本研究で日常診療において実用的なディプロタイプ解析の方法を確立させ、NUDT15 多型に応じた6-MPの至適投与量での治療が可能となることを目指す。
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Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、2010年1月以降に山口大学医学附属病院小児科で急性リンパ性白血病と診断し、維持療法で6-メルカプトプリンを投与した症例を対象とした。方法としては、患者末梢血中に含まれる正常白血球からキットを用いてDNAを抽出した。次に、キットを用いてPCRを行い、NUDT15 エクソン1およびエクソン 3領域を増幅した。続いて、増幅したPCR産物の塩基配列をダイレクトシーケンス法によりNUDT15多型の有無について解析した。 ダイレクトシーケンスの結果、対象のうち21例が解析でき、16例がNUDT15多型なし、5例が多型ありであった。多型ありの内、3例がc.415C>Tのヘテロ接合性多型、1例がc.52G>Aとc.415C>Tの2つのヘテロ接合性多型、残りの1例がc.415C>Tのホモ接合性多型とc.36_37insGGAGTCのヘテロ接合性多型を有していた。 2つのヘテロ接合性多型を持つ症例について、ディプロタイプ解析のためクローニングを用いた解析を行った。まず、正常白血球から抽出したmRNAを用いて相補的DNA(cDNA)を合成した。合成したcDNAをキットを用いてクローニングし、合計9個のコロニーが得られた。ダイレクトシーケンスを用いて解析を行った結果、2種類の多型はそれぞれ別のアレルに存在することが分かり、複合ヘテロ接合性多型であるとわかった。 また、同症例をデジタルPCRを用いてディプロタイプ解析を行った。まず多型を有するアレルが標識されるようなプローブを設計し解析した結果、c.52G>Aの多型を有する集団とc.415C>Tの多型を有する集団とに分かれ、デジタルPCRで複合ヘテロ接合性多型であることが確認できた。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在、解析済みの複合ヘテロ接合性多型を有する1症例に関しては、計画通り多型の塩基配列に対して特異的なプローブを用いることで解析が可能であった。 一方、既報告で複合ヘテロ接合性多型を有する症例は約6%存在することから、対象症例の内2~3例の症例が存在する見込みであったが、現時点で複合ヘテロ接合性多型を有する症例は1例のみであり、他の多型に関してデジタルPCRを用いた解析ができない状況である。
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Strategy for Future Research Activity |
現在、複合ヘテロ接合性多型を有する症例で認めている2つの多型(c.52G>A、c.415C>T)以外の多型について、それぞれの多型の塩基配列に対して特異的なプローブを作成し、デジタルPCRで解析可能か検討することで、今後同じ多型を有する複合ヘテロ接合性多型の症例に対して有用かどうか事前に検討しておく。 また、さらなる症例集積のため、他施設の症例も解析できるように臨床試験を計画し、山口大学医学部附属病院における治験及び人を対象とする生命科学・医学系研究等倫理審査委員会に承認を得た。今後はさらに解析を継続し、複合ヘテロ接合性多型を有する症例を複数集積し検討する予定である。
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