Mitochondrial disease gene analysis focusing on RNA splicing abnormalities
| Project/Area Number |
22K15950
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
八塚 由紀子 順天堂大学, 大学院医学研究科, 助教 (20458524)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
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| Keywords | ミトコンドリア病 / スプライシング異常 / ゲノム解析 / RNAスプライシング / エキソンスキップ |
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| Outline of Research at the Start |
我々の研究グループが長年にわたるミトコンドリア病研究の中で蓄積してきた臨床情報・次世代シーケンサー（NGS）関連データセット・患者由来細胞・両親兄弟検体を最大限に活用し、遺伝子診断が困難なイントロン領域のバリアント評価に挑む。先行研究で取得したNGS関連データセットには膨大な数のスプラインシング関連バリアントが含まれ、全てについて検証実験を行うことは現実的に不可能であるため、具体的に検証可能な数まで絞り込む方法が必須である。
本研究で構築するバリアント評価システムはゲノム配列のみからバリアントの病原性を評価する手法であり、臨床的意義不明バリアントの解決策の1つになり得る。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム解析技術が飛躍的に進歩してもなお、エクソンから3塩基以上離れた位置に存在するイントロン領域のバリアントに対してゲノムDNAの配列解析からその影響を予測することは困難な状況の中、これまでの認識より広い範囲の配列保存性が報告された（Ferraro et al, Science,2020）。そこで、新規の病的バリアント同定を目指し、我々の研究グループがミトコンドリア病遺伝子解析を通して蓄積してきた1,500超の症例のNGSデータセットに対して精査を行った。
具体的には、診断確定済症例も含めた全データセットからバリアントを抽出し（約27,000件）、Ferraroらの見出した配列保存性をもとに絞り込みを行った。既知の病的バリアントが抽出できていることを確認すると同時に、新たな候補バリアントを取得した（約200件）。これらの臨床的意義不明バリアント（VUS, Variant of Uncertain Significance）の中から個々の症例の遺伝形式や臨床症状に鑑み、優先順位をつけて検証実験を進めており、期待する結果が得られている。
解析成功例を挙げると、遺伝子Xのスプライシングドナー側＋5塩基に位置するホモ接合型バリアントは、前述の配列保存性から逸脱しており病的バリアントである可能性が考えられた。患者由来細胞でトランスクリプトーム解析を行ったところ、遺伝子Ｘの発現が著減していた。かろうじて検出された転写産物には当該バリアントを原因とするエクソンスキップが生じており、Premature Termination Codon出現によるNonsense-mediated-decay（NMD）と考えられた。患者細胞を用いたウェスタンブロッティングにおいて翻訳産物Xは全く検出されなかった。
初年度には合計7症例（6遺伝子）に新規のスプライシング異常を明らかにした。本研究において構築中のデータ解析手法により、スプライシング異常が原因となって発症する未診断ミトコンドリア病症例の遺伝子診断が効率的に進んでいる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本手法で絞り込んだVUSを対象として、主にRNAを用いた検証実験を進めてきた。すでに複数症例において実際にスプライシング異常が生じていることが確認できている。次年度にはまとまった数の全血トランスクリプトームデータが得られるため、さらなるスプライシング関連バリアントが明らかになると期待できる。本研究の成果をまとめた論文報告が可能であると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
2023年度はスプライシング異常の検証を行う際、患者皮膚線維芽細胞由来RNAに加えて、全血由来RNAの使用を開始する。ミトコンドリア内で機能するタンパクのほとんど（>95%）が全血由来RNAにおいても問題なく検出できるという予備データを得ており、患者由来細胞が樹立できていない症例においても検証実験が進むと考えられる。2023度前半には合計64症例（初年度に採血済）の全血RNAトランスクリプトーム解析を行う。すでに細胞樹立済の症例においては、RNAを用いた検証に加え、ウェスタンブロッティングによるタンパク発現の確認、遺伝子レスキュー実験などを行う。
また、2023年度も引き続き新規受入症例のゲノム配列解析を行い、新たに同定したスプライシング関連バリアントを順次検証実験に追加し、スプライシング異常を引き起こすと思われるVUSの病原性を明らかにしていく。
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Report
(1 results)
Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Strategic validation of variants of uncertain significance in ECHS1 genetic testing2023
Author(s)
Yoshihito Kishita, Ayumu Sugiura, Takanori Onuki, Tomohiro Ebihara, Tetsuro Matsuhashi, Masaru Shimura, Takuya Fushimi, Noriko Ichino, Yoshie Nagatakidani, Hitomi Nishihata, Kazuhiro R Nitta, Yukiko Yatsuka, Atsuko Imai-Okazaki, Yibo Wu, Hitoshi Osaka, Akira Ohtake, Kei Murayama, Yasushi Okazaki
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Journal Title
Journal of Medical Genetics
Volume: Online ahead of print
Issue: 10
Pages: 1006-1015
DOI
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Peer Reviewed
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