クローン病の腸管線維化と粘膜低酸素領域との関連性の免疫学的解明

• Project/Area Number: 22K16015
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 53010:Gastroenterology-related
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 村手 健太郎 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (50936549)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2024: ¥390,000 (Direct Cost: ¥300,000、Indirect Cost: ¥90,000); Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000); Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
• Keywords: クローン病 / 腸管線維化 / 粘膜低酸素領域 / 免疫学的解析

Outline of Research at the Start

クローン病（CD）の次世代型治療として、抗炎症治療のみならずその後に生じる線維化を予防する新たな治療法の開発が喫緊の課題となっている。
腸管の線維化は、線維芽細胞等の活性化に伴う細胞外マトリクス等の産生が要因とされ、その活性化には組織に浸潤する免疫細胞が深く関与している。加えて、腸管は低酸素環境であり、近年CD患者の組織に発現する低酸素関連転写因子（HIF）の活性化がCDの病態に深く関連していることが報告されている。
本研究課題では、クローン病（CD）患者において低酸素状態により誘導される線維化メカニズムを解明し、CDの線維化を予防する薬剤および予測法の開発につなげることを目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

概要）
我々は低酸素領域での免疫細胞の関与に、CD患者の腸管の過度の線維化を起こすプロセスがあるのでは無いかと仮定し実験を計画した。
①On timeで低酸素領域を同定できる内視鏡を用いて経時的なsample採取を行い、網羅的解析を含めた免疫学的解析を施行し関連因子及び関連pathwayを同定する。②独自に開発した小腸線維化モデルマウスをbaseに、特定した因子のコンディションノックアウトマウスを作成しin vivo実験を行い、同定した因子の線維化との関連を解明する。③小腸線維化部位より採取した腸管線維芽細胞を用いたin vitro実験を計画している。
１、異なる経過を取った患者（軽度線維化、過度の線維化）の時系列sampleを（炎症期、線維化期の低酸素領域及び正常領域）を用いて患者間での比較をRNAseqにて網羅的解析を実施し、その中からkeyとなる因子（Factor-X）を同定した。現在Factor-Xによる過度の線維化に寄与するメカニズムを模索している。また今回の網羅的解析において、低酸素部位でdown-regulateするpathwayとして、あるcytokine receptorに関連するpathwayを同定した。我々が以前施行した別のCD患者の線維化部位の（内視鏡的）低酸素領域及び正常領域での免疫細胞解析により、特定の免疫細胞が関連している可能性を考慮していたが、今回の網羅的解析でも同様の結果であった。２、また我々独自に開発した小腸線維化モデルマウスについても同上の免疫細胞及びFactor-Xの関連を確認した。３、また小腸線維化部位より採取した腸管線維芽細胞と特定の免疫細胞およびFactor-Xを共培養することにより、腸管線維芽細胞が過度の線維化を起こすことを確認した。
上記実験の結果より、我々の着目している因子は線維化の差異に関連している可能性が高いと考えている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

進捗状況）
異なる経過を取った患者（炎症→軽度線維化、炎症→過度の線維化）の時系列sampleを（炎症期、線維化期の低酸素領域及び正常領域）を用いて患者間での比較をRNAseqにて網羅的解析を実施した。
ただ、前年度の報告でも言及したが、COVID19の影響で一時sampleの採取が予定よりも大幅に遅れた。
なんとかsampleの採取及び解析が終了し、解析の結果、複数の関連因子を同定し、それら因子のRNAレベル及び蛋白レベルの発現の差を確認した。その中からkeyとなる因子（Factor-X）を同定した。現在Factor-Xによる過度の線維化に寄与するメカニズムを模索している。また今回の網羅的解析において、低酸素部位でdown-regulateするpathwayとして、あるcytokine receptorに関連するpathwayを同定した。（我々は元々ある免疫細胞に着目した解析を計画していたので、我々の予想通りであった。）
我々が以前施行した別のCD患者の線維化部位の（内視鏡的）低酸素領域及び正常領域での免疫細胞解析により、特定の免疫細胞が関連している可能性を考慮していたが、今回の網羅的解析でも同様の結果であった。また我々独自に開発した小腸線維化モデルマウスについても同上の免疫細胞及びFactor-Xの関連を確認した。また小腸線維化部位より採取した腸管線維芽細胞と特定の免疫細胞およびFactor-Xを共培養することにより、腸管線維芽細胞が過度の線維化を起こすことを確認した。上記実験の結果より、我々の着目している因子は線維化の差異に関連している可能性が高いと考えている。

Strategy for Future Research Activity

今後の展望）
特定の免疫細胞におけるFactor-Xが腸管線維化の本質に関連する可能性を考慮し、CD患者の線維化部位の内視鏡sampleや手術検体を用いて、現在メカニズムの解明の為の追加免疫学的解析を施行している。
現在、独自に作成した小腸線維化マウスにFactor-Xの阻害剤を投与し、効果判定している途中である。
またFactor-Xのコンディションノックアウトマウスの作成を進めて、解析していく予定である。