炎症性腸疾患の上皮異常脱分化および発癌機構をシングルセル解析で解明する

• Project/Area Number: 22K16018
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 53010:Gastroenterology-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 坂口 大起 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (70897876)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: 炎症性腸疾患 / 炎症性発癌 / シングルセルゲノミクス / オルガノイド

Outline of Research at the Start

傷害上皮の脱分化は発癌との関連が示唆されているが、炎症性腸疾患（IBD）における異常脱分化と炎症性発癌との関連性は未だ明らかにされていない。また脱分化にはエピゲノム制御変化が関与するとされているが、IBDに特異的なエピゲノム異常と脱分化との関連性を検討した報告も皆無である。本研究ではIBDの外科切除検体から腸管上皮細胞を精製し、シングルセルレベルでトランスクリプトームおよびエピゲノム解析を施行して疾患特異的な異常脱分化細胞を探索する。その細胞集団の発生機序ならびに炎症性発癌との関連性を解明し、癌化を抑制しながら脱分化を促して組織修復を早めるというIBDの新たな治療ストラテジーの開発も目指す。

Outline of Annual Research Achievements

令和５年度は潰瘍性大腸炎（UC）患者大腸上皮細胞のscRNA-seq解析により同定された、疾患特異的発現プロファイルを呈する細胞集団の機能解析を進めた。この細胞集団の機能的特徴を推測すべくエンリッチメント解析を行うと、細胞分裂やアポトーシス抵抗性に関する経路が上位に挙がってくることから、この細胞集団は上皮バリア構造の修復に有益な機能を有している可能性が高いと考えている。UC患者外科切除検体から大腸上皮オルガノイドを樹立してその発現プロファイルも同様にscRNA-seqで解析すると、先述の細胞集団のマーカー遺伝子の発現亢進はオルガノイドでも保存されており、さらには複数種の炎症性サイトカイン刺激を低用量で持続的に加えることで、正常細胞のアポトーシスは亢進する一方で疾患特異的細胞集団は相対的に増殖活性もアポトーシス抵抗性も高いことから細胞競合に打ち勝ってより濃縮され、マーカー遺伝子の発現もさらに増幅されることを見出した。疾患特異的細胞集団のマーカー遺伝子の発現が亢進する条件でサイトカイン低用量持続刺激を加えたオルガノイドは、高い細胞増殖活性を反映するとされる嚢胞状の形態を呈し、さらには細胞増殖活性と逆相関するCFSEならびにアポトーシス活性と相関するアネキシンVを用いて染色しフローサイトメトリーで蛍光強度を定量すると共に有意な低下を示したことから、先述のエンリッチメント解析の結果に矛盾なくこの細胞集団の細胞増殖活性亢進ならびにアポトーシス活性抑制の双方が確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通り、シングルセルRNAシーケンシング解析で見出したUC患者に特異的な発現プロファイルを呈する細胞集団の機能的特徴が明らかになってきているため、本研究は概ね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

我々が見出した疾患特異的細胞集団の高い細胞増殖活性ならびにアポトーシス抵抗性を規定するマーカー遺伝子の同定を目指している。本細胞集団において発現が亢進している遺伝子の中でも、特にFold changeの高い分子として特定の転写因子に着目している。UC患者由来のオルガノイドから、CRISPR/Cas9 systemを用いてその転写因子を欠損させたオルガノイドを作製し、野生型に比し細胞増殖活性やアポトーシス活性が抑制されるかを検証する予定としている。
並行して疾患特異的細胞集団の腸炎組織修復作用をin vivoレベルで検証すべく、先述のごとくサイトカイン低用量持続刺激によってマーカー遺伝子の発現をより亢進させたオルガノイドをDSS腸炎モデルマウスの大腸粘膜に移植し重症度変化の評価を進めている。