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Establishment of liver metabolism disease model using human hepatic progenitor cells induced by small molecule compounds.

Research Project

Project/Area Number 22K16023
Research Category

Grant-in-Aid for Early-Career Scientists

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section Basic Section 53010:Gastroenterology-related
Research InstitutionKumamoto University

Principal Investigator

稲田 浩気  熊本大学, 病院, 特任助教 (20930291)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
KeywordshCLiP / OTC / ATP7B / CRISPR-Cas9 / 肝細胞 / 胆管細胞 / ヒト肝前駆細胞 / 肝再生 / 肝代謝疾患
Outline of Research at the Start

ヒト肝細胞から低分子化合物を用いて誘導したヒト肝前駆細胞 (Human Chemically-induced Liver Progenitors:hCLiP) を使い、先天性肝代謝疾患の代表疾患であるWilson病や尿素回路異常症の疾患モデルを作製し、さらにオルガノイド培養法および免疫不全マウスへの移植実験により、in vitroならびにin vivoでの疾患解析ツールを確立させる。

Outline of Annual Research Achievements

ヒト肝細胞から低分子化合物を用いて誘導したヒト肝前駆細胞 (Human Chemically-induced Liver Progenitor:hCLiP) の安定的な継代培養の培養条件を確立した。また、hCLiPをマトリゲル培養させることで肝細胞への分化誘導実験も試みたところ、肝細胞マーカーであるAlb, ASGPR1, MRP2, CYP3A4の発現上昇を認めた。一方で未熟マーカーであるAFPや、胆管細胞マーカーのCK19の発現低下がまだ不十分であるため、成熟肝細胞へ分化に向けたさらなる条件検討が必要であることが明らかになった。
ATP7B欠損のhCLiPを確立させるため、CRISPR-Cas9法でのノックアウト実験を行った。まずは標的遺伝子であるATP7B遺伝子に対するガイドRNAとCas9を共発現するAll-in-oneタイプのプラスミドベクターを設計した。同様にOTC欠損のhCLiPを確立させるため、OTC遺伝子に対するガイドRNAとCas9を共発現するAll-in-oneタイプのベクターを設計した。これらを用いてCRISPR-Cas9法でのノックアウト実験を行った。リポフェクション法でトランスフェクションを行い、puromycinでselectionを行って細胞を回収しRNAを抽出、逆転写を行いcDNAを合成した。qPCRを行い、ATP7BならびにOTC遺伝子の発現を解析したものの、良好なノックアウト効率は得られていなかった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ATP7B遺伝子欠損ならびにOTC遺伝子欠損のhCLiPを確立させるためにCRISPR-Cas9法でのノックアウト実験を行ったが、リポフェクションでのノックアウトではノックアウト効率が良くないことが判明したため。

Strategy for Future Research Activity

リポフェクションの条件検討や、複数のプラスミドベクターを作成してリポフェクションを行うことや、レンチウイルスベクターの系を用いるなど、ノックアウト効率を向上させるためにあらゆる手段を講じる。

Report

(2 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • Research Products

    (2 results)

All 2024 2023

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results)

  • [Journal Article] A novel, small anti-HBV compound reduces HBsAg and HBV-DNA by destabilizing HBV-RNA2024

    • Author(s)
      Watanabe Takehisa、Hayashi Sanae、Zhaoyu Yan、Inada Hiroki、Nagaoka Katsuya、Tateyama Masakuni、Tanaka Yasuhito
    • Journal Title

      Journal of Gastroenterology

      Volume: 59 Issue: 4 Pages: 315-328

    • DOI

      10.1007/s00535-023-02070-y

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Randomized phase I/II study of vascular endothelial growth factor receptor peptide vaccines for patients with hepatocellular carcinoma2023

    • Author(s)
      Yoshimaru Yoko、Nagaoka Katsuya、Tanaka Kentaro、Narahara Satoshi、Inada Hiroki、Kurano Sotaro、Tokunaga Takayuki、Iio Etsuko、Watanabe Takehisa、Setoyama Hiroko、Tateyama Masakuni、Yoshida Koji、Tsunoda Takuya、Nakamura Yusuke、Tanaka Motohiko、Sasaki Yutaka、Tanaka Yasuhito
    • Journal Title

      Hepatology Research

      Volume: - Issue: 5 Pages: 451-464

    • DOI

      10.1111/hepr.13995

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access

URL: 

Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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