膵癌エクソソームと癌関連線維芽細胞を介した薬剤耐性機序解明と診断法の確立

• Project/Area Number: 22K16031
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 53010:Gastroenterology-related
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 島本 奈々 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (90908055)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
• Keywords: 膵癌 / エクソソーム / 薬剤耐性 / CD44v6 / 癌関連線維芽細胞

Outline of Research at the Start

CAFから膵癌細胞への増殖因子の接着分子であるCD44v6は薬剤耐性能促進因子である。我々は、膵癌細胞から分泌されたCD44v6+エクソソームがCAFの形質変化をもたらし、その結果CAFから膵癌細胞へ、薬剤耐性を促進する増殖因子が分泌されると仮説を立てた。CD44v6+エクソソームを介した膵癌細胞とCAFの相互連携の分子病理学的機構を解明すべく、タンパク発現解析やRNAseqによる解析を行い、膵癌モデルマウスを用いてCD44v6+エクソソームのが抗癌剤治療に与える影響を解析する。また、臨床試験として、膵癌患者の血清CD44v6エクソソーム発現量を定量化し、治療との相関関係を解析する。

Outline of Annual Research Achievements

2023年度はCD44v6以外に薬剤耐性に関与する可能性のあるエクソソームの探索を行った。理由は、CD44v6はsplicing variant formであり、PCRのプライマーやCRISPER/Cas9によるノックアウトに際して、variant6のみを標的とする遺伝子操作が不可であることが判明したためである。
新規の薬剤耐性に関与するエクソソームの探索にあたっては、各ステージの膵癌患者からそれぞれ血清を採取し、血清中のエクソソームの網羅的解析を行った。その後、統計学的手法により化学療法の効果と連動する可能性のあるエクソソームタンパク質候補を抽出した（複数）。
次に、候補エクソソームタンパク質に関してin vitroでの解析を行うため、複数の膵癌細胞株と正常膵管上皮細胞株を用いて、PCRおよびウエスタンブロットにて候補タンパク質の遺伝子発現量、細胞およびエクソソームにおける発現量を検討した。その結果、候補タンパク質はいずれも正常膵癌細胞株に比較して膵癌細胞株で遺伝子発現量、細胞における発現量、エクソソームにおける発現量が高いことが判明した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

エクソソームタンパク質の網羅的解析により薬剤耐性と連動する可能性のある候補タンパク質がいくつか抽出された。これらのタンパク質に関して、CAFとの関連をin vitroで解析するという課題が今年度の大きな目標である。また、別コホートによる臨床検体でのvalidationに関しては、現在症例を蓄積中であり、今年度中に解析を急ぐ。
以上の理由から、本来の計画からは遅れているものの膵癌の薬剤耐性に関してエクソソームが果たす役割を解明するための研究は着実に進行している。

Strategy for Future Research Activity

今後は、候補エクソソームタンパク質が膵癌細胞と癌関連線維芽細胞(CAF)をどのように関連させ、薬剤耐性へと導くのかを解析する。具体的には、候補タンパク質に関して過剰発現株(OE株)を作成し、通常株（Wt株）とOE株から各々エクソソームを回収する。これらのエクソソームをCAFに添加することによりCAFの特徴である筋線維能(α-SMA、コラーゲンtype1など)の評価や、産生する細胞増殖因子であるHGF、CXCL12などの発現をRT-PCRやELISAを用いて解析する。またエクソソームにより移送される候補タンパク質による膵線維芽細胞の網羅的な遺伝子発現解析のためRNAseqを行い、線維芽細胞の形質変化を包括的にとらえる。次に、各エクソソームで添加刺激した膵線維芽細胞(upper)と膵癌細胞株(lower)で共培養し、癌細胞のGEM投与による50%阻害濃度(IC50%)の変化を解析することで、分泌因子による薬剤耐性誘導を評価する。同定された分泌因子の添加により薬剤耐性誘導された癌細胞のRNAseq解析を行うことにより、候補エクソソームタンパク質のCAFへの相互連関が薬剤耐性に関与するシグナル伝達を含めた詳細な分子機序を明らかにする。
臨床検体でのvalidationでは、膵癌（各ステージ）から血清を採取し、エクソソームを抽出する。候補エクソソームタンパク質をELISAで定量化し、化学療法の効果別での差を検討することにより、候補エクソソームタンパク質が薬剤耐性を予測するマーカーとなりうるかを検討する。