心臓におけるミトコンドリア分解制御機構の解明と心不全治療薬創薬に向けた基礎的検討

• Project/Area Number: 22K16102
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 53020:Cardiology-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 村川 智一 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (50902194)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000); Fiscal Year 2022: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
• Keywords: マイトファジー / Bcl2-L-13 / 心不全 / オートファジー / ミトコンドリアダイナミクス

Outline of Research at the Start

心不全は未だ予後不良の疾患であり、新規治療標的も定まっていない。ミトコンドリアは細胞内のエネルギー産生に重要な役割を果たしているが、心不全症例では異常ミトコンドリアの蓄積が見られる。そのメカニズムは解明されておらず、異常ミトコンドリアの効率的な分解が心不全の新たな治療戦略となりうる。我々は、ミトコンドリア選択的分解機構であるマイトファジーに着目し、マイトファジー誘導分子としてBcl2 like protein 13を同定した。本研究では、Bcl2 like protein 13の生体における役割及び、活性化機構を明らかにすることで創薬につながる分子標的を同定し、新規心不全治療への応用を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

in vivo実験として、Bcl2-L-13 S272Aノックインマウスを用いて横行大動脈縮窄術（TAC）による圧負荷誘導性心不全モデルを作製した。本年度は昨年度に取得したタンパク質、mRNA、組織サンプルの解析を行った。ノックインマウスにおいても、心筋におけるnppbのmRNAレベルは野生型に比し有意な上昇を認めた。また、ノックインマウスでは野生型に比し、線維化や肥大の程度が増強していた。
in vitro実験については、Bcl2-L-13 Ser272の責任kinaseを探索するため、siRNAライブラリのスクリーニングを進めている。1次スクリーニングでは、脱共役剤であるCCCP投与により誘導されるBcl2-L-13のリン酸化を抑制するものを候補として選択した。Bcl2-L-13のリン酸化はanti-phospho-Bcl2-L-13 S272抗体による免疫染色で得られるシグナル数をカウントすることで評価した。ライブラリでは、１種類のkinaseにつき３種類のsiRNAが供与されている。そこで、3つのうち1つで60%以上のリン酸化抑制が見られるもの、3つのうち2つ以上で40%以上のリン酸化抑制が見られるものをヒットとして取得した。この結果、74の候補を得た。さらに候補を絞るために、2次スクリーニングを行っている。2次スクリーニングでは、ノックダウンにより実際にCCCPにより誘導されるマイトファジーを抑制する候補を選択する。ATP synthase抗体によりミトコンドリアを、LC3B抗体によりオートファゴソームを染色し、共局在点を計測することでマイトファジーを評価する。この実験を1次スクリーニングで得た74の候補について行っており、現時点で大半の評価が終了している。